王田田，周星，柏玉香，王金鵬，謝正軍，金征宇

(江南大學，食品組分與物性中心，江蘇 無錫，214122)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)是一種多功能性酶，屬于α-淀粉酶家族。CGTase 可以同時催化4 種不同的反應，包括水解反應，環(huán)化反應，耦合反應，歧化反應［1，4］。利用CGTase 環(huán)化反應生產(chǎn)環(huán)糊精(CDs)是CGTase 的一種重要應用，隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領域的應用越來越廣，生產(chǎn)環(huán)糊精所必需的CGTase 越來越成為當今學者研究的熱點［2-4］。然而利用CGTase 環(huán)化作用生產(chǎn)環(huán)糊精，得到的往往是α-CD，β-CD 及γ-CD3 種環(huán)糊精的混合產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)中，產(chǎn)品的后續(xù)分離純化操作復雜而耗時。因此，對CGTase 的產(chǎn)物專一性研究一直以來都是研究者們探究的熱門課題［4-13］。荷蘭格羅寧根大學的Dijkhuizen 團隊以底物麥芽低聚糖中的葡萄糖基為參照，標記出了+2 ～-7 這9 個該酶與底物的結(jié)合亞位點［4，20-22］(圖1)，確定了該CGTase 環(huán)化作用的主要產(chǎn)物與底物結(jié)合亞位點密切相關，只有當環(huán)化作用前伴隨耦合反應時，才能產(chǎn)生其他種類的環(huán)狀糊精。而根據(jù)CGTase 的酶與底物的結(jié)合模型分析，在CGTase 活性中心的底物結(jié)合位點附近存在一定的空間，反應過程中的生成受體糖苷儲存在其中，導致耦合作用或歧化作用的發(fā)生，從而改變產(chǎn)物中3種環(huán)糊精的比例，影響產(chǎn)物專一性［15-16］。

綜上可知，酶自身的結(jié)構(gòu)的不同，以及反應過程中耦合歧化作用的發(fā)生，是影響CGTase 產(chǎn)物專一性的2 個重要因素。目前國內(nèi)對于CGTase 產(chǎn)物專一性的研究大多集中于前者，通過抑制酶的耦合歧化作用來提高CGTase 產(chǎn)物專一性的研究目前還很少研究［17］。我們希望通過超高壓作用壓縮CGTase 底物結(jié)合位點附近空間大小，抑制耦合歧化作用的發(fā)生，最終提高CGTase 產(chǎn)物專一性。

圖1 來源于B. circulans 251 的CGT 酶與麥芽九糖抑制劑在活性位點上相互作用示意圖［4，19］Fig.1 Schematic representation of the interactions between B. circulans strain 251 CGTase and a maltononaose at the active site［4，19］

食品超高壓處理是指使用100 MPa 以上(100 ～1 000 MPa)的壓力，在常溫下或較低溫度下對食品物料進行處理，從而達到滅菌、物料改性和改變食品某些理化反應速度的效果［18］。超高壓能夠影響非共價鍵的形成與破壞，但不破壞共價鍵，非共價鍵是維持酶分子高級結(jié)構(gòu)的主要原因，因而超高壓能夠影響酶分子的高級結(jié)構(gòu)［19］。

目前，還沒有人研究超高壓對CGTase 酶學性質(zhì)及其產(chǎn)物專一性的影響。本研究旨在通過調(diào)整高壓腔內(nèi)介質(zhì)的溫度，壓力，改變高壓后酶反應的時間，探究高壓過程對于α-CGTase 產(chǎn)物專一性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

軟化芽孢桿菌α-CGTase，日本天野酶制品株式會社;α-CD、β-CD 及 γ-CD 標 準 樣 品，SIGMAALDRICH 公司;可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、超純水均為色譜級;其他試劑均為分析純。

1.2 實驗設備

雙光束紫外可見分光光度計(TU-1900)，北京普析通用儀器有限責任公司;電熱恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學儀器廠;高效液相色譜儀(LC-20AT 230V)，島津公司;示差折光檢測器(RID-10A)，島津公司;Hypersil NH2色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm APS-2 Hypersil 微粒)，美國Thermo 公司;S-FL-085-09-W 超高壓儀器，英國Stansted Fluid Power 公司。

2 實驗方法

2.1 試樣的準備

取一定量pH 6.0 磷酸緩沖液稀釋的酶于2mL的甘油管中，保障甘油管中盛滿酶液且殘余氣泡體積盡量少(防止高壓過程中氣泡的存在使得甘油管爆裂)。將甘油管4℃冰浴保存，等待高壓處理或作為對照樣等待檢測酶活性。

為了避免實驗數(shù)據(jù)受實驗操作和酶的放置時間的影響，同批次試樣均一次制作完成，放置在4℃的冰浴里，并在12 h 內(nèi)高壓處理完畢，處理后試樣保存在4℃的冰箱里，在48 h 內(nèi)完成過α-CGTase 活性檢測。所有數(shù)據(jù)均為3 個試樣測試后的平均值［23］。

2.2 超高壓處理

高壓處理:先將與超高壓儀器相連的水浴鍋設定到實驗指定溫度，待溫度穩(wěn)定20 min 后，將試樣浸沒于高壓容器的傳壓介質(zhì)中，按照實驗設計，設定壓力、保壓時間等參數(shù)，進行超高壓處理。

2.3 α-環(huán)化活力的測定

將適當稀釋經(jīng)高壓處理過的α-CGTase 的酶液加入裝有預先用50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0)配制2 g/100 mL 可溶性淀粉溶液的試管中，充分混勻，在60 ℃反應10 min 后，沸水浴10 min 終止反應。以未經(jīng)高壓處理過的α-CGTase 做對照組進行反應。使用HPLC 測定產(chǎn)物中α-CD 含量。酶活力單位(U)定義為:在上述條件下每分鐘生成1μmol α-環(huán)糊精所需的酶量［24-25］。

2.4 HPLC 法測定環(huán)糊精產(chǎn)量

采用HPLC 法進行酶產(chǎn)物分析。用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)配制2 g/100 mL 淀粉溶液，沸水浴中加熱糊化10 min，冷卻至反應溫度后添加一定量的α-CGTase，充分混勻后在60 ℃、200 r/min 水浴搖床中反應一定時間，沸水浴10 min 滅酶后于12 000 r/min 離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm 超濾膜過濾后取20μL 上機分析。采用HPLC 進行產(chǎn)物分析的色譜條件為:流動相為65%乙腈水溶液，流速1 mL/min;柱溫40℃。

3 結(jié)果與分析

3.1 環(huán)糊精產(chǎn)量的HPLC 法測定

利用HPLC 對反應產(chǎn)物中α-CD，β-CD，γ-CD 進行檢測，如圖2 所示，α-CD，β-CD，γ-CD 3 種環(huán)糊精的出峰位置分別為7.557，8.709，10.369。

反應得率:

產(chǎn)物專一性:

其中，B1，B2，B3分別表示α-CD，β-CD，γ-CD 的含量，mg/mL;M 表示參與反應的總淀粉的含量，mg/mL。

3.2 壓力對α-CGTase 環(huán)化反應的影響

為了探究α-CGTase 在不同高壓下的變化特性，在40 ℃、保壓10 min、酶液pH 值為6.0 的條件下，進行5 種壓力(100、200、300、400 和500 MPa)的高壓處理，對照組為常壓(0.1 MPa)40 ℃水浴10 min 后的酶。α-CGTase 催化淀粉反應10 h，利用HPLC 測得環(huán)糊精含量，從而得到壓力對α-CGTase 產(chǎn)物專一性的影響，實驗結(jié)果如表1 所示。

圖2 α-CGTase 催化淀粉反應產(chǎn)物中的α-，β-，γ-CD 的液相圖Fig.2 HPLC chromatogram of α-，β-，γ-CD from starch catalyzed by α-CGTase

表1 不同壓力對于α-CGTase 的影響Table 1 Effect of different pressures on α-CGTase

由表1 可見，在40 ℃下，用不高于200 MPa 的壓力處理CGTase，α-CGTase 的環(huán)化活力有一定的升高，當壓力≥300 MPa，隨著壓力增大酶迅速失活;而隨著壓力的增大，α-CGTase 的產(chǎn)物專一性均有明顯的提高;產(chǎn)物得率則隨壓力的升高而逐漸降低。推測造成以上現(xiàn)象的原因可能是:在40 ℃和200 MPa 左右的較低壓力下，高壓作用主要對酶起到壓縮效應，改變酶蛋白的非共價結(jié)構(gòu)，沒有破壞酶蛋白骨架結(jié)構(gòu)［18-19］，對酶的環(huán)化活力有一定的增強作用，隨著壓力的逐漸增大，酶蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶逐漸失活;而高壓過程導致α-CGTase 底物結(jié)合位點附近空間被壓縮，反應過程中的耦合作用和歧化作用受到抑制，酶環(huán)化反應產(chǎn)物專一性得到增強。

3.3 溫度對α-CGTase 環(huán)化反應的影響

為了考察α-CGTase 超高壓處理時溫度對酶環(huán)化反應的影響，實驗設定壓力為200 MPa、酶液pH 值6.0(酶的最適PH)，保壓10 min 的條件下，進行5 種保壓溫度(25、40、50、60 和70 ℃)的高壓處理，對照組為常壓(0.1 MPa)相應溫度水浴10 min 的α-CGTase。α-CGTase 催化淀粉反應10 h，利用HPLC 測得環(huán)糊精含量，從而得到溫度對α-CGTase 產(chǎn)物專一性的影響。實驗結(jié)果如表2 所示。

表2 不同溫度下高壓對于α-CGTase 的影響Table 2 Effect of pressures on α-CGTase at different tempreture

由表2 可以看出，在200 MPa 下，不同溫度處理α-CGTase 后，其環(huán)化活力隨溫度升高而降低，25℃時環(huán)化活力最大;而產(chǎn)物專一性隨著溫度的升高先增大后減小，在40℃時最大為55.9%;產(chǎn)物得率隨著溫度的升高在不斷減小。由此可以推斷，在200 MPa 低溫(≦40℃)處理酶后，高壓對于α-CGTase 底物結(jié)合位點附近空間有壓縮效應，可以一定程度地抑制反應過程中的耦合作用和歧化作用，從而提高產(chǎn)物專一性;200 MPa 和較高溫度(＞40℃)作用后，由于溫度與高壓的協(xié)同作用，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，環(huán)化反應減弱且產(chǎn)物專一性變差。而由于高壓與溫度的協(xié)同作用，破壞酶底物結(jié)合中心蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)［18-19］，使得α-CGTase 與淀粉的結(jié)合能力變?nèi)?，?CGTase 得率隨著溫度的升高而下降。

3.4 高壓后反應時間對α-CGTase 產(chǎn)物專一性的影響

由于α-CGTase 催化淀粉反應過程中，隨著反應時間的不同，各種催化作用的強弱也各不相同，最終導致3 種環(huán)糊精比例隨反應時間不同而不同［15-16］。為了進一步探究超高壓對于α-CGTase 產(chǎn)物專一性影響，通過將超高壓處理后的α-CGTase 設置不同的反應時間，來探究不同壓力作用于α-CGTase 后該酶產(chǎn)物專一性的變化。實驗設定保壓溫度為40℃、酶液pH 值為6.0(酶的最適pH)，保壓時間為10 min 的條件下，進行5 種壓力(100、200、300、400 和500 MPa)的高壓處理，對照組為常壓(0.1 MPa)40℃水浴10 minα-CGTase。高壓處理α-CGTase 后，酶與淀粉的反應時間分別為10 min，1 h，10 h。超高壓處理酶后不同反應時間對α-CGTase 產(chǎn)物專一性的影響如圖3 所示，產(chǎn)物得率的變化規(guī)律如圖4 所示。

圖3 高壓后的α-CGTase 在不同反應時間下產(chǎn)物專一性的變化Fig.3 The changes of product specificities of α-CGTase treated by various pressures at different reaction times

圖4 不同高壓處理后的α-CGTase 在不同反應時間下產(chǎn)物得率的變化Fig.4 The changes of production yields of α-CGTase treated by various pressures at different reaction times

由圖3 可知，隨著反應時間的延長，α-CGTase 產(chǎn)物專一性不斷降低;在相同反應時間下，產(chǎn)物專一性隨著處理α-CGTase 的壓力增大而提高。由圖4 可知，隨著處理α-CGTase 壓力的增大，α-CGTase 催化淀粉反應產(chǎn)物得率不斷降低;而隨著α-CGTase 催化淀粉反應時間的延長，α-CGTase 催化淀粉反應產(chǎn)物得率不斷提高。這是由于α-CGTase 催化淀粉反應是一個動態(tài)的多催化作用反應過程，α-CGTase 同時發(fā)揮這4 種催化作用，尤其是在反應的后期，反應體系中有多種底物存在，耦合歧化作用增強，因此反應時間越長，產(chǎn)物的專一性越低，同時產(chǎn)物的得率越高。

4 結(jié)論

超高壓處理α-CGTase，隨著壓力的增大，α-CGTase 的環(huán)化活力先有一定的升高，然后快速降低，且不論反應時間的長短，在同一反應時間下，產(chǎn)物專一性均隨壓力增大而不斷提高，在500 MPa 時催化淀粉反應10 h，產(chǎn)物專一性將達到71.75%，但產(chǎn)物的得率均隨著壓力提高而減小。在200 MPa 下，不同溫度處理α-CGTase 后，其環(huán)化活力隨溫度升高而降低，25℃時環(huán)化活力最大，為62.49 U/ mL;而產(chǎn)物專一性隨著溫度的升高先增大后減小，在40℃時最大為55.9%;產(chǎn)物得率隨著溫度的升高在不斷減小。此外，在相同高壓條件下，產(chǎn)物專一性隨反應時間延長而降低，產(chǎn)物得率隨反應時間延長而增大。本文主要討論了不同壓力，溫度下高壓處理α-CGTase 后環(huán)化反應產(chǎn)物專一性的變化，以及高壓過后不同的反應時間下酶產(chǎn)物專一性的變化，對于高壓處理后酶結(jié)構(gòu)的變化還需進一步研究。

［1］ Van der Veen B，van Alebeek G，Uitdehaag J，et al. The three transglycosylation reactions catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans (strain 251)proceed via different kinetic mechanisms［J］. European Journal of Biochemistry，2000，267(3):658 -665.

［2］ Li Z F，Wang M，Wang F，et al.γ-Cyclodextrin:a review on enzymatic production and applications［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2007，77(2):245 -255.

［3］ van de Manakker F，Vermonden T，van Nostrum C F，et al. Cyclodextrin-based polymeric materials:synthesis，properties，and pharmaceutical/biomedical applications［J］. Biomacromolecules，2009，10(12):3157 -3175

［4］ 李兆豐，顧正彪，堵國成，等. 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征與催化機理［J］. 中國生物工程雜志，2010，30(6):144 -150

［5］ Tonkova A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22(8):678-686.

［6］ Li Z F，Zhang J Y，Sun Q，et al. Mutations of lysine 47 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans enhance β-cyclodextrin specificity［J］. Journal Agricultural and Food Chemistry，2009，57(18):8 386-8 391.

［7］ Li Z F，Zhang J Y，Wang M，et al. Mutations at subsite-3 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans enhancing α-cyclodextrin specificity［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83(3):483-490.

［8］ Kelly R M，Dijkhuizen L，Leemhuis H. The evolution of cyclodextrin glucanotransferase product specificity［J］. Applied Microbiology Biotechnology，2009，84(1):119 -133.

［9］ 丁閏蓉，李兆豐，李金根，等. 表面活性劑對大腸桿菌胞外生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響［J］. 中國生物工程雜志，2009，29(7):61 -66.

［10］ 李兆豐. 軟化類芽孢桿菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達及其產(chǎn)物特異性分析［D］. 無錫:江南大學，2009.

［11］ Leemhuis H，Kelly RM，Dijkhuizen L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85(4):823 -835.

［12］ 曹新志，金征宇. 環(huán)糊精包合物的制備方法［J］. 食品工業(yè)科技，2003，24(10):158 -160.

［13］ 曹新志，金征宇. 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的快速篩選［J］. 中國糧油學報，2003，18(6):53 -55.

［14］ Penninga D，van der Veen B，Knegtel R，et al. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase fom Bacillus circulans strain 251［J］. Journal of Biological Chemistry，1996，271(51):32 777 -32 784.

［15］ Uitdehaag J，Kalk K，van der Veen B，et al. The cyclization mechanism of cyclodextrin glycosyltransferase as revealed by a γ-cyclodextrin-CGTase complex at 1.8? resolution［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274(49):34 868 -34 876.

［16］ Schmidt A，Cottaz S，Driguez H，et al. Structure of cyclodextrin glycosyltransferase complexed with a derivative of its main product β-cyclodextrin［J］. Biochemistry，1998，37(17):5 909 -5 915

［17］ Ramli N，Abd-Aziz S，Hassan M，et al. Potential cyclodextrin glycosyltransferase producer from locally isolated bacteria［J］. African Journal of Biotechnology，2010，9(43):7 317 -7 321.

［18］ 陳復生. 食品超高壓加工技術［M］. 北京:化學工業(yè)出版社，2005.

［19］ Zhengyu Jin，Xiuting Hu，Xueming Xu，et al. Retrogradation properties of rice starch gelatinized by heat and high hydrostatic pressure (HHP)［J］. Journal of Food Engineering，2011，106(3):262 -266.

［20］ Strokopytov B，Knegtel R M，Penninga D，et al.Structure of cyclodextrin glycosyltransferase complexed with a maltononaose inhibitor at 2.6 angstrom resolution. Implications for product specificity［J］. Biochemistry，1996，35(13):4 241 -4 249.

［21］ Bender H. Studies of themechanism of the cyclisation reaction catalysed by the wild type and a truncated α-cyclodextrin glycosyltransferase from Klebsiella pneumoniae strain M5 al and the β-cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 8［J］. Carbohydrate Research，1990，206(2):257 -267.

［22］ Wind R D，Uitdehaag J C M，Buitelaar R M，et al，Engineering of cyclodextrin product specificity and pH optima of the thermostable cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1［J］.The Journal of Chemical Physics，1998，273(10):5 771-5 779.

［23］ 曾慶梅，潘見，謝慧明，等. 超高壓處理對多酚氧化酶活性的影響［J］. 高壓物理學報，2004，18(2).

［24］ Lejeune A，Sakaguchi K，Imanaka T.A spectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose(α-cyclodextrin)glucanotransferase［J］. Analytical Biochemistry，1989，181(1):6 -11.

［25］ 劉虹，顧正彪，洪雁，等.甲基橙褪色分光光度法定量測定α-環(huán)糊精［J］.中國糧油學報，2008，23(5):1 773 -1 776.