周緒霞，徐瀟穎，趙丹丹，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

發(fā)酵魚制品作為一種新型的魚類加工方法，是利用乳酸菌等食品微生物對魚體進行發(fā)酵，使其產(chǎn)生一定的風(fēng)味并能在室溫下保藏較長時間，同時還具有除腥的作用［1-2］。目前，對發(fā)酵魚制品的研究也較多，如楊穎等［3］通過加曲、分段加鹽的生產(chǎn)工藝縮短魚露的發(fā)酵周期，改善產(chǎn)品風(fēng)味;盧曉莉等［4］采用固態(tài)發(fā)酵法，研究食鹽添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對發(fā)酵魚鲊品質(zhì)的影響;張芝芬等［5］則利用正交分析研究了魚體水分含量、食鹽和酒糟添加量對糟魚品質(zhì)的影響。

但目前對魚及其制品發(fā)酵所選用的發(fā)酵劑多為乳酸菌或曲霉，而且發(fā)酵魚制品多以整條魚或魚露進行發(fā)酵，尚未有利用毛霉對魚糜制品進行發(fā)酵的相關(guān)研究。而毛霉用作腐乳生產(chǎn)的發(fā)酵劑，在安全性及酶學(xué)作用相似，這提示可以將腐乳的發(fā)酵原理與工藝應(yīng)用于魚糜原料的加工中，開發(fā)新的魚糜制品。本實驗室嘗試將傳統(tǒng)的腐乳生產(chǎn)加工工藝應(yīng)用于新型魚糜制品的開發(fā)中以更好地利用海洋資源，并改變真菌固態(tài)發(fā)酵劑多用于植物性食品的現(xiàn)狀，賦予魚糜制品更高的營養(yǎng)價值。

真菌固態(tài)發(fā)酵過程一般分為前酵和后酵2 個階段［6］。前酵階段主要是毛霉在豆腐白坯上的生長過程，使菌絲體包裹坯體，賦予其較好的成形性，同時產(chǎn)生降解蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的酶系;后酵則是前酵產(chǎn)生的酶系與腌鹵中多種物質(zhì)協(xié)同作用的過程［7］。而完成前酵之后所得的毛坯，需經(jīng)食鹽腌制后才能進行后酵工藝。食鹽的加入一方面可以使坯體適當(dāng)脫水收縮變硬，防止后酵過快酥爛;另一方面可以適當(dāng)抑制酶系的催化作用，起到一定程度的防霉抑菌作用，同時可以賦予魚糜制品一定的咸味，起調(diào)味助鮮作用［8］。腌制中食鹽滲透速度是防腐關(guān)鍵，對后酵過程中產(chǎn)品的成形性及風(fēng)味形成也具有重要作用。而食鹽滲透速度與溫度、食鹽添加量、水分含量以及制品本身質(zhì)構(gòu)有關(guān)［9］。本實驗室目前已經(jīng)完成了毛霉發(fā)酵魚糜的前酵研究，在此基礎(chǔ)上，本研究以前酵后的魚糜毛坯為原料，研究毛坯在不同濃度食鹽腌制過程中的鹽分傳遞規(guī)律以及相關(guān)生化指標的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑

主要試劑:甲醛，MgO，H3BO3，AgNO3等為分析純，購自杭州高精細化工;食鹽為食品級，購自超市。

菌種:毛霉(Mucor XH-22)為咸亨腐乳廠保藏菌種。

魚糜為海產(chǎn)低值魚糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，貯藏于-20℃冰箱中備用。

魚糜毛坯制備:毛霉固體斜面活化后，接種于麩皮培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)2 ～3 h。用滅菌的蒸餾水洗出孢子液，過濾后控制孢子懸液濃度為105～106CFU/mL。低值魚糜按比例加入食鹽(1%)、葡萄糖(2%)、玉米淀粉(5%)、大豆分離蛋白(10%)后擂潰塑形、蒸煮冷卻后，切成1.5 cm ×1.5 cm ×1 cm 小塊，接種105～106CFU/mL 的孢子懸液后置于28℃、RH 95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，即得到毛坯。

1.1.2 儀器和設(shè)備

AR2130 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市江南儀器廠;CR21GⅡ高速冷凍離心機，日本日立公司;PHS-3C pH 酸度計，杭州雷磁分析儀器廠;DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;LRH-250A 生化培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司。

1.2 樣品制備

將完成前期固態(tài)真菌發(fā)酵的魚糜毛坯分別添加16%，20%，24%的食鹽，在常溫及4℃下腌制48 h，每隔12 h 取樣測定相關(guān)指標。

1.3 測定方法

1.3.1 水分含量測定

參照GB/T 14769—1993，采用常壓加熱干燥法測定。

1.3.2 總酸值和氨基酸態(tài)氮(amino acid nitrogen，ANN)含量測定

參照GB/T 5009.39—2003。取5.0 g 樣品，加入45mL 煮沸的去離子水，打漿1 min 后，在4℃冰箱中抽提30 min，離心(10 000 r/min，10 min)取清液待測。移取10 mL 清液加入60 mL 去離子水后，用標準NaOH 溶液進行電位滴定，至pH 8.2。消耗標準NaOH 即為樣品中總酸的含量，結(jié)果以乳酸計(乳酸換算系數(shù)取0.09)。加入10 mL 中性甲醛溶液，繼續(xù)滴定至pH 9.2 止，第2 次滴定所消耗標準NaOH 的量即為氨基態(tài)氮值，最終結(jié)果以干基計。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)含量測定

采用半微量擴散法［10］。

1.3.4 NaCl 含量測定

采用硝酸銀滴定法［11］。

1.3.5 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2 -2010。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 17.0 和Origin7.5 軟件進行數(shù)據(jù)分析。測定結(jié)果以均值±標準差(Mean ±SD)表示，采用最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性分析，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 腌制過程中魚糜毛坯含水量的變化

圖1 顯示了腌制過程中魚糜毛坯含水量的變化。從圖中可以看出，在腌制的48 h 內(nèi)，毛坯的含水量都呈下降趨勢，其中0 ～24 h 含水量下降較快，之后趨于平穩(wěn)。隨食鹽添加量的增加，含水量下降速度加快。溫度對腌制魚糜毛坯的重量變化影響較大，在相同食鹽添加量下，低溫腌制過程中毛坯含水量的變化顯著低于常溫腌制(P ＜0.05)，主要是因為溫度的升高，食鹽擴散的活化分子數(shù)目增加，擴散能力加大，同時介質(zhì)的流動性增加，阻力減少，同一時間內(nèi)滲透發(fā)生的重量變化較大［5］。

腌制后魚糜毛坯的含水量會影響后酵過程產(chǎn)品品質(zhì)。含水量過高說明水分析出較少，所得鹽坯的含水量高，組織結(jié)構(gòu)致密性差，后期蛋白酶酶解易導(dǎo)致坯體出現(xiàn)成熟酥爛;而析出水分過多，則會使魚糜毛坯蛋白質(zhì)細胞組織過度脫水，導(dǎo)致后期難以復(fù)原，腐乳中常稱“腌煞坯”。腐乳生產(chǎn)中，一般控制鹽坯含水量在58%左右，常溫腌制下，24 h 后食鹽添加量20%和24%組的魚糜毛坯含水量都已低于腐乳鹽坯的要求，而低溫腌制組，48 h 后食鹽添加量24%組才達到58%左右，所以，低溫可以減緩腌制過程中含水量下降的速度。

圖1 腌制過程中魚糜毛坯含水量的變化Fig.1 The changes of content changes in the surimi pehtze during salting

2.2 腌制過程中魚糜毛坯的食鹽含量及其滲透速度變化

魚糜毛坯腌制過程中鹽含量的變化如表1 所示。0 ～48 h，不同腌制條件下毛坯的含鹽量都隨著腌制時間的增加而增加;相同食鹽添加量組，低溫條件下毛坯中含鹽量要低于常溫。這是因為溫度升高分子運動加劇，分子運動速率提高，鹽分向魚糜毛坯擴散的速度加快［12］，這與Denmier 等［13］等對青魚的研究結(jié)果相似。腐乳生產(chǎn)中常將食鹽含量達到12%作為腌制結(jié)束的指標。表中，16%食鹽添加量組在腌制48 h 后坯體中含鹽量仍在12%以下，20%添加量組在腌制36 h 后鹽含量升至13%左右，24%添加組腌制24 h 后即大于12%，說明除了溫度以外，食鹽添加量也是決定食鹽擴散速度的一個因素。

表1 腌制過程中魚糜毛坯含鹽量變化 %Table 1 The changes of salt content changes in the surimi pehtze during salting

不少研究者應(yīng)用擴散菲克第二定律研究魚的鹽制過程鹽擴散的常用定律［14-15］。Teils 等基于菲克第二定律研究了凱門鱷肌肉的鹽漬過程中鹽的擴散與溫度、鹽濃度的關(guān)系［16］，對食鹽添加量和環(huán)境溫度對魚糜毛坯在腌制過程中的含鹽量用下述公式進行近似擬合:ln(C0-Cx)= -kt+lnC0，其中C0為NaCl添加量;Cx 為腌制過程中魚糜毛坯的NaCl 含量，則式中k 為食鹽滲透速度常數(shù)(min-1)。本研究參照以上公式，根據(jù)食鹽添加量與魚糜毛坯中NaCl 含量隨腌制時間的變化，用ln(C0-Cx)對時間t 作圖，其直線斜率即為速度常數(shù)k，得到的腌制過程中魚糜毛坯的滲透速度常數(shù)如圖2 所示。

從圖2 可以看出，魚糜毛坯中鹽的滲透符合菲克第二定律，且速度常數(shù)隨食鹽添加量的增加而增大。20℃下食鹽添加量從16%，20%到24%，速度常數(shù)分別為1.53 ×10-2，1.66 ×10-2到1.75 ×10-2/min(P＜0.05)(圖a)，而4℃下食鹽添加量其速度常數(shù)分別為1.28 ×10-2，1.49 ×10-2到1.64 ×10-2/min(圖b)，差異顯著(P ＜0.05)。這是由于在同一溫度下，食鹽添加量越大，其滲透壓和擴散濃度梯度就越大，因此滲透的速度就越高［17］。在相同的食鹽添加量下，溫度高，食鹽的滲透速度常數(shù)也較大，說明溫度是影響滲透速度的一個因素，這與席慶等的研究相符［18］。而食鹽滲透的速度也與圖1 中含水量下降的快慢呈正比，滲透常數(shù)越大，含水量下降得越快。

2.3 腌制過程中魚糜毛坯氨基態(tài)氮含量的變化

圖2 腌制過程中魚糜毛坯的滲透速度常數(shù)Fig.2 The changes of salt penetration rate constant in the surimi pehtze during salting

食鹽腌制過程包括了2 個傳質(zhì)過程:一個是鹽分滲透進入魚糜毛坯中，另外一個是水分析出，即表現(xiàn)出的重量變化。同時，鹽漬過程伴隨著很多化學(xué)變化的發(fā)生，鹽漬時魚體和微生物酶的作用，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生分解，產(chǎn)生游離氨基酸及小分子肽等，肌肉產(chǎn)生可溶性成分包括蛋白質(zhì)和氨基酸等也隨鹵水而溶出。

圖3 反映了腌制過程中魚糜毛坯氨基態(tài)氮含量的變化。0 ～48 h，魚糜毛坯中的氨基態(tài)氮含量隨腌制時間和食鹽添加量的增加而下降，常溫及低溫腌制48h 后氨基態(tài)氮值分別在0.25%和0.3%左右。該值下降的主要原因是腌制過程中，一方面，高鹽含量抑制了微生物的酶解作用;另一方面，游離氨基氮隨鹵水流失的速度要大于微生物酶解產(chǎn)生的速度，所以魚糜毛坯中氨基態(tài)氮含量下降［19］。相同食鹽添加量下低溫腌制過程中氨基態(tài)氮的下降速度顯著低于常溫，因此，低溫可以降低食鹽滲透和水分析出的速度，從而控制了氨基態(tài)氮的流失速度，該變化規(guī)律與食鹽的滲透速度及含水量下降情況相符。

圖3 腌制過程中魚糜毛坯的氨基態(tài)氮含量變化Fig.3 The changes of amino-nitrogen content in the surimi pehtze during salting

2.4 腌制過程中魚糜毛坯TVB-N 含量的變化

圖4 為腌制過程中魚糜毛坯中TVB-N 含量的變化。TVB-N 是水產(chǎn)品鮮度的一個代表，反映酶和細菌對蛋白的作用程度。從圖4a 可以看出，常溫腌制的3 組毛坯TVB-N 值都隨腌制時間增加呈先下降后上升趨勢，在相同腌制時間下，TVB-N 值隨食鹽添加量的增加而降低，48 h 后按食鹽添加量從低到高TVB-N 值依次為17.53，15.90 和14.53 mg/100g，都在30 mg/100g 的鮮度范圍內(nèi)，分析24 h 開始出現(xiàn)的TVB-N 值的上升可能與部分腐敗菌生長有關(guān)［20］。低溫腌制過程中毛坯中TVB-N 值呈下降趨勢(圖b)，且隨食鹽添加量增加下降趨勢增加，這主要是由于食鹽滲透作用使部分胺類物質(zhì)隨水分流失所致。與常溫腌制相比，低溫腌制過程中TVB-N 值下降的速度較慢，這與食鹽滲透速度較慢有關(guān)，低溫條件和較高的含鹽量能在一定程度上抑制微生物生長，因此，低溫腌制后期未出現(xiàn)TVB-N 值上升的趨勢。

圖4 腌制過程中魚糜毛坯的揮發(fā)性鹽基氮變化Fig.4 The changes of TVB-N content in the surimi pehtze during salting

2.5 腌制過程中魚糜毛坯中菌落總數(shù)的變化

圖5 顯示了腌制過程魚糜毛坯中菌落總數(shù)的變化。從圖5 可以看出，低溫腌制過程中魚糜的菌落總數(shù)一直呈下降趨勢，腌制48 h 后，16%、20%和24%NaCl 3 組魚糜的菌落總數(shù)從初始的8.17 ×108CFU/g分別降低到48h 的4.27 ×108、2.45 ×108和1.91 ×108CFU/g(P ＜0.05);常溫腌制的前24h 內(nèi)菌落總數(shù)下降，但隨后又逐漸增加，到48h 時，6%、20%和24% NaCl 3 組菌落總數(shù)分別為1.70 ×108、1.17 ×108和6.61 ×107CFU/g，顯著高于相應(yīng)的低溫腌制組(P＜0.05)。腐乳腌制階段，菌落總數(shù)由近109CFU/g下降至108CFU/g 以上［21］。分析常溫腌制后期微生物大量繁殖的原因，主要是由于水分析出，使魚糜坯體表面的食鹽濃度開始下降，導(dǎo)致食鹽對微生物的抑制作用減弱，且適宜的溫度也是微生物迅速生長的原因;而低溫腌制過程中，較低的溫度及食鹽對微生物有雙重抑制作用，且高鹽含量能殺死部分微生物，所以整個腌制過程中，菌落總數(shù)始終呈下降趨勢。而常溫腌制后期菌落總數(shù)的快速增加也是引起TVB-N 值上升的主要原因(圖4a)。

在相同腌制溫度下，不同NaCl 添加量組的菌落總數(shù)間呈顯著差異(P ＜0.05)。隨食鹽添加量的增加，菌落總數(shù)下降，這與較高的含鹽量抑制了微生物的生長繁殖相關(guān)。

圖5 腌制過程中魚糜毛坯的菌落總數(shù)變化Fig.5 The changes of aerobic plate count in the surimi pehtze during salting

3 結(jié)論

本文研究了不同食鹽添加量以及不同的腌制溫度對腌制過程魚糜毛坯中各指標的動態(tài)變化。研究結(jié)果表明:常溫腌制狀態(tài)下，食鹽的滲透速度較快，能使魚糜毛坯在較短的時間內(nèi)達到成熟鹽坯所要求的含鹽量及含水量，可以縮短生產(chǎn)周期，但常溫腌制易引起后期的細菌繁殖，過快的滲透速度使魚糜制品的營養(yǎng)成分損失較大。而低溫的腌制可以降低食鹽的滲透速度，雖然腌制周期較長，但所獲得的的鹽坯的食鹽分布較均勻，營養(yǎng)成分流失減小，且低溫可以抑制細菌繁殖，故低溫腌制比常溫腌制獲取的鹽坯品質(zhì)較優(yōu)，綜合考慮將加鹽量20%在低溫環(huán)境下腌制36h作為最優(yōu)工藝。

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