李璐，梁祖培，周綺姍，陳茹，林思良

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

吡蟲啉是廣泛用于茶葉、水稻、棉花等多種農(nóng)作物病蟲害防治的高效、低毒、廣譜性殺蟲劑，具有一定的細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，對人體具有一定的致突變和致癌風(fēng)險，國內(nèi)外已制訂了多種農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［1-3］。目前對吡蟲啉的檢測主要以高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等為主。由于吡蟲啉通常以痕量形式存在于復(fù)雜樣品中，普遍存在前處理過程繁瑣、高毒有機(jī)溶劑用量大、富集效果不好等問題。因此探索一種簡單高效、選擇性強(qiáng)的富集方法具有十分重要的意義。

分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種具有分子識別能力的新型高分子材料，由于它具有預(yù)定性、專一性等優(yōu)點(diǎn)，因此在色譜分離、抗體模擬、固相萃取、生物傳感器及模擬酶催化等諸多領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景［4-6］。為此，將對模板分子具有特殊選擇性的分子印跡聚合物用于吡蟲啉的分離富集引起廣泛關(guān)注［7-9］。

本研究采用懸浮聚合法制備吡蟲啉分子印跡聚合物，采用電鏡掃描、靜態(tài)吸附和固相萃取等方式研究各因素對分子印跡聚合物性能的影響，并用正交實驗對合成配方進(jìn)行優(yōu)化，研究其特異吸附性能，以尋求一種簡單高效的吡蟲啉富集和提純新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

吡蟲啉(陜西蘇秦農(nóng)藥廠，純度95%);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(廣州雙鍵公司，分析純);丙烯酸(AA)(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純);偶氮二異丁腈(AIBN)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純);丙酮(衡陽市凱信化工試劑有限公司，分析純);二氯甲烷(廣東光華科技股份有限公司，分析純);甲醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，色譜純);冰乙酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)。

HY-4 調(diào)速振蕩器(常州澳華儀器有限公司);78-1 磁力加熱攪拌器(金壇市富華儀器有限公司);754 紫外-可見分光亮度計(上海菁華科技儀器有限公司);SH 系列鼓風(fēng)干燥箱(上杭儀器有限公司);HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);增力無極恒速攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);XL30 環(huán)境掃描電子顯微鏡(荷蘭菲利浦電子光學(xué)有限公司);57044 型真空固相萃取裝置(上海楚定分析儀器有限公司)。

1.2 吡蟲啉分子印跡聚合物的制備

采用懸浮聚合法制備吡蟲啉分子印跡聚合物。稱取適量吡蟲啉、8 mmol AA 加入裝有適量甲醇的錐形瓶中，置于磁力攪拌器上常溫攪拌1 h，使模板分子與功能單體充分作用。然后加入交聯(lián)劑EGDMA 和50 mg AIBN，繼續(xù)攪拌10 min，使超分子配合物與交聯(lián)劑和引發(fā)劑充分接觸。最后轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，在70 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)24 h，攪拌速度控制在100 ～200 r/min。

對所得懸濁液進(jìn)行抽濾，用體積分?jǐn)?shù)95 %乙醇和蒸餾水各清洗2 次，70 ℃干燥12 h，然后用丙酮溶液于65 ℃恒溫抽提8 h，再用蒸餾水反復(fù)清洗聚合物，70 ℃干燥12 h，得到聚合物粉末。

非印跡聚合物(non-imprinted polymers，NIPs)的合成及處理方法除不加入模板分子之外，其余步驟同上。

1.3 分子印跡聚合物的吸附性能

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以二氯甲烷為溶劑，配制濃度為10 ～50 mg/L 的吡蟲啉溶液，用紫外分光亮度計在270 nm 波長處測定不同濃度下吡蟲啉溶液的吸光度，平行測定3 次，取平均值。從吸光度-濃度曲線圖得到吸光度-濃度關(guān)系式:y=0.000 6 x，R2=0.995 3。

1.3.2 吡蟲啉分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附性能

準(zhǔn)確稱取100 mg MIPs 微球，置于250 mL 的磨口三角瓶中，加入100 mL 濃度為0.5 g/L 的吡蟲啉的二氯甲烷溶液。室溫下振蕩24 h 后，靜置5 min，然后轉(zhuǎn)移到離心管中，3 000 r/min 離心10 min，取上層清液1 mL，用二氯甲烷稀釋10 倍，用紫外分光光度計在270 nm 處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算底物的平衡濃度。根據(jù)吸附前后底物濃度的變化，由式1 計算出聚合物的平衡吸附量。

其中:Q，靜態(tài)平衡吸附量(mg/g);cS0，底物的起始濃度(g/L);cS，底物吸附平衡時的濃度(g/L);V，底物溶液的體積(mL);m，MIPs 的質(zhì)量(g)。

1.4 吡蟲啉分子印跡聚合物的固相萃取性能

取100 mg 吡蟲啉分子印跡聚合物，干法裝柱。先用3 mL 水和3 mL 二氯甲烷對分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活化。然后取適量吡蟲啉溶液分上MIPs 柱，控制其流速為1 mL/min。選擇體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇-水溶液作為淋洗劑，體積分?jǐn)?shù)為10 %的乙酸-甲醇溶液作為洗脫劑，對固相萃取柱進(jìn)行淋洗和洗脫，控制其流速為1 mL/min。

收集洗脫液，用紫外分光光度計在270 nm 處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算洗脫液的吡蟲啉濃度。根據(jù)萃取前后吡蟲啉濃度的變化，由式2 計算出吡蟲啉溶液的回收率。

其中:cS0，吡蟲啉的起始濃度(g/L);cS，吡蟲啉洗脫液濃度(g/L)。

1.5 Scatchard 分析

分子印跡研究中一般用Scatchard 模型來評價分子印跡聚合物對模板分子的結(jié)合能力以及識別機(jī)理，Scatchard 方程表達(dá)式如下:

其中:Q，吸附量(mg/g);c，模板在吸附液中的平衡濃度(g/L);Qmax，結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量(mg/g);Kd，結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)(mg/L)。

1.6 吡蟲啉分子印跡聚合物的形貌

用XL30 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀測吡蟲啉分子印跡聚合物的形貌和分散度。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板分子用量對MIPs 性能的影響

模板分子中所含極性功能基團(tuán)的數(shù)量對形成聚合物的親和性和選擇性有很大影響。分別取吡蟲啉2、2.5 和3 mmol，EGDMA 和甲醇用量固定為40 mmol 和100 mL，用1.2 方法制備吡蟲啉分子印跡聚合物。模板分子吡蟲啉用量對所得MIPs 性能的影響見圖1 和圖2。

圖1 為不同模板分子用量所得MIPs 對不同初始濃度吡蟲啉的等溫吸附線，由圖1 可以看出，不同模板分子用量所得印跡聚合物的平衡吸附量均隨底物濃度的增加而增加，在考察范圍內(nèi)，模板分子用量小時，所得聚合物的平衡吸附量較大，這可能是由于當(dāng)模板分子用量較多時，多余的模板分子會阻礙吸附位點(diǎn)的形成，從而導(dǎo)致吸附量減小。

圖1 不同吡蟲啉用量制備的MIP 等溫吸附曲線Fig.1 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of imidacloprid

不同模板分子用量制得的MIPs 的掃描電鏡圖如圖2 所示?？梢钥闯觯０宸肿拥挠昧繉酆衔锏谋砻嫘螒B(tài)有較大的影響。吡蟲啉濃度為2 mmol 時，制得MIPs 粒徑較均勻，孔穴較多，當(dāng)吡蟲啉濃度增大到3 mmol 時，聚合物有明顯的結(jié)塊現(xiàn)象。

2.2 交聯(lián)劑用量對MIPs 性能的影響

交聯(lián)劑是成功制備分子印跡聚合物的一個重要因素，它控制聚合物的形態(tài)、印跡點(diǎn)的穩(wěn)定性及聚合物的機(jī)械穩(wěn)定性，所以交聯(lián)劑的類型及用量直接影響MIPs 中交聯(lián)的功能單體數(shù)目和交聯(lián)度，進(jìn)而影響分子印跡聚合物的選擇性和結(jié)合容量［10］。分別取EGDMA 的用量為40、45 和50 mmol，吡蟲啉和甲醇用量固定為2 mmol 和100 mL，按1.2 方法制備吡蟲啉分子印跡聚合物，研究交聯(lián)劑EGDMA 用量對MIPs的飽和吸附量和形貌特性的影響，見圖3 和圖4。

圖2 不同模板分子用量所得MIPs 的SEM 圖Fig.2 MIPs from different dosage of template molecules of SEM figure(×12 800)

圖3 為不同EGDMA 用量所得印跡聚合物對不同初始濃度吡蟲啉的等溫吸附線。由圖3 可知，隨著EGDMA 用量的增大，MIPs 的吸附能力增強(qiáng)，但增幅不太明顯。在EGDMA 用量為40 mmol 時，最大平衡吸附量為246 mg/g，EGDMA 的用量增大到50 mmol時，最大平衡吸附量增大至284 mg/g，增幅為15.44%。其原因一方面是隨EGDMA 用量的增加，MIPs中結(jié)合點(diǎn)密度增大，從而導(dǎo)致吸附性能增強(qiáng);而另一方面，隨著EGDMA 用量的增大，制得的MIPs 剛性增強(qiáng)，MIPs 結(jié)構(gòu)更加緊密，導(dǎo)致更多的結(jié)合點(diǎn)難于被底物接近，進(jìn)而導(dǎo)致MIPs 的吸附能力減弱。兩方面的原因綜合導(dǎo)致EGDMA 用量的改變對吸附性能影響不明顯。

圖3 不同EGDMA 用量制備的MIP 等溫吸附線Fig.3 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of EGDMA

不同交聯(lián)劑用量制得的MIPs 的掃描電鏡圖如圖4 所示?？梢钥闯鏊镁酆衔锉砻嫘螒B(tài)差異不大，粒徑較均勻且都具備較好的多孔結(jié)構(gòu)，有利于吸附。適當(dāng)增加交聯(lián)劑的用量可以增加聚合物的剛性，但用量過大時，多余的交聯(lián)劑發(fā)生自身聚合，從而影響MIPs 的特異吸附［11］。

圖4 不同交聯(lián)劑用量所得MIPs 的掃描電鏡圖(×12 800)Fig.4 Different dosage of crosslinking agent from SEM picture of MIPs (×12 800)

2.3 溶劑用量對MIPs 性能的影響

在MIPs 的制備過程中，溶劑不僅對參加聚合反應(yīng)的反應(yīng)物如模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等有很好的溶解作用，而且還是制備MIPs 的致孔劑，會影響功能單體和印跡分子間的結(jié)合強(qiáng)度、動力學(xué)性質(zhì)和聚合物的形態(tài)結(jié)構(gòu)，特別是在非共價鍵的結(jié)合體系中顯得尤為重要［12］。本研究選擇極性物質(zhì)甲醇為溶劑，分別取甲醇的用量為100、120 和150 mL，吡蟲啉和EGDMA 用量固定為2 mmol 和40 mmol，按1.2 方法制備吡蟲啉分子印跡聚合物，研究甲醇用量對MIPs的飽和吸附量和形貌特性的影響，實驗結(jié)果見圖5 和圖6。

圖5 為不同甲醇用量所得MIPs 對不同初始濃度吡蟲啉的等溫吸附線?？梢钥闯觯S著甲醇用量的增大，MIPs 的吸附能力減弱。在甲醇用量為100 mL時，平衡吸附量為246 mg/g，當(dāng)甲醇用量增大至150 mL 時，平衡吸附量減小至195 mg/g，這可能是因為過多的溶劑使MIPs 的結(jié)構(gòu)疏松、硬度變低而影響了吸附識別效果。

不同甲醇用量制得的MIPs 的掃描電鏡圖見圖6。從圖6 可知，當(dāng)甲醇用量為100 mL 時，所得聚合物表面粒徑最均勻且分散度較低。

圖5 不同甲醇用量制備的MIPs 等溫吸附曲線Fig.5 MIP isothermal adsorption curve of the preparation of different dosage of methanol

圖6 不同溶劑用量所得MIP 的掃描電鏡圖(×12 800)Fig.6 Different dosage of solvent agent from SEM picture of MIPs(×12 800)

2.4 正交實驗優(yōu)化

根據(jù)前述單因素實驗結(jié)果，選取吡蟲啉(模板分子)、EGDMA(交聯(lián)劑)、甲醇(溶劑)設(shè)計三因素三水平正交實驗，方案如表1。以平衡吸附量和回收率為指標(biāo)進(jìn)行正交實驗，實驗結(jié)果見表2。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal experiment

由表2 可知，以平衡吸附量為指標(biāo)時，在試驗設(shè)計的范圍內(nèi)，3 種因素用量對聚合物的平衡吸附量的影響次序從大到小依次為:吡蟲啉＞EGDMA ＞甲醇，此時的吡蟲啉分子印跡聚合物的最優(yōu)配方為A1B3C3，即:吡蟲啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol。此時的平衡吸附量最大，為361 mg/g。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments

當(dāng)以加標(biāo)回收率為指標(biāo)時，在試驗設(shè)計的范圍內(nèi)，3 種因素用量對聚合物的平衡吸附量的影響次序從大到小依次為:吡蟲啉＞甲醇＞EGDMA，吡蟲啉分子印跡聚合物的最優(yōu)配方為A2B2C3，即:吡蟲啉2.5 mmol，EGDMA 45 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol。此時回收率最高，為127 %。

由于2 個指標(biāo)所得的最優(yōu)配方不同。綜合考慮，對于平衡吸附量來說，主要影響因素為A 和B，最優(yōu)水平組合是A1B3;對于回收率而言，主要影響因素為A 和C，最優(yōu)水平組合是A2C3。在對A1和A2進(jìn)行選擇時，研究發(fā)現(xiàn)，選擇A2時平衡吸附量比選擇A1減少了24%，而回收率增加了16.5%，故最優(yōu)水平確定為A1。因此，制備吡蟲啉分子印跡聚合物的最優(yōu)水平組合為A1B3C3，即:吡蟲啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA 8 mmol，此時所得MIPs 的靜態(tài)吸附的平衡吸附量為361 mg/g，固相萃取回收率為94.6 %。

2.5 聚合物的吸附特性

對最優(yōu)組合制備的MIPs 與NIPs 比較其平衡吸附量和回收率，結(jié)果如表3 所示，表明所得印跡聚合物對吡蟲啉具有特異性吸附。這是由于模板分子的加入導(dǎo)致模板與功能單體間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，當(dāng)模板分子被洗脫后，在聚合物內(nèi)部形成了形狀和官能團(tuán)位置均與吡蟲啉相配合的空腔，正是由于這些空腔的存在，使MIPs 對模板具有良好的選擇性結(jié)合能力。雖然NIPs 和吡蟲啉也能形成氫鍵，但由于位置關(guān)系，不具有作用位點(diǎn)的匹配，阻礙同其他分子的作用，因此對吡蟲啉的吸附量較小。

表3 MIPs 吸附特性Table 3 Adsorption characteristics of MIPs

2.6 Scatchard 分析結(jié)果

對吸附等溫線的結(jié)果進(jìn)行Scatchard 分析，分析結(jié)果如圖7 所示?？梢钥闯鯭/c 與Q 呈非線性關(guān)系，將圖中散點(diǎn)分為2 個部分分別進(jìn)行線性回歸可以得出2 條直線，線性方程分別為:Q/c = 11.467 -0.060 9 Q 以及Q/c =0.854 1 -0.001 4 Q。結(jié)果表明在研究的范圍之內(nèi)，MIPs 對模板分子的吸附本質(zhì)并非均一相同的，MIPs 對模板分子的吸附可能存在2種吸附作用，一種為表面吸附，貢獻(xiàn)主要來自于物理吸附;另一種為化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)吸附。根據(jù)直線的斜率和截距可以分別計算出兩類吸附的平衡解離常數(shù)Kd和最大表觀吸附量Qmax分別為:Kd1=16.42 mg/L、Qmax1= 188.29 mg/g;Kd2= 714.29 mg/L、Qmax2=610.08 mg/g。

圖7 吡蟲啉分子印跡聚合物Scatchard 方程分析圖Fig.7 Imidacloprid molecularly imprinted polymer Scatchard equation analysis diagram

3 結(jié)論

本文以丙烯酸(AA)為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，在甲醇溶液中用懸浮聚合法合成了吡蟲啉分子印跡聚合物。通過對所得分子印跡聚合物平衡吸附量、回收率和表觀特性的研究，采用正交實驗優(yōu)化得到最優(yōu)配方為吡蟲啉2 mmol，EGDMA 50 mmol，甲醇150 mL，AIBN 0.05 g，AA8 mmol，此時MIPs 的飽和吸附量為361 mg/g，回收率為94.6%。

對優(yōu)化合成得到的吡蟲啉分子印跡聚合物的吸附性能進(jìn)行研究，與非印跡聚合物的平衡吸附量和回收率對比表明所得MIPs 具有特異吸附性。Scatchard分析表明，所得吡蟲啉分子印跡聚合物存在2 種不同的結(jié)合位點(diǎn)，最大表觀吸附量(Qmax)和平衡離解常數(shù)(Kd)分別為Kd1=16.42 mg/L、Qmax1=188.29 mg /g;Kd2=714.29 mg/L、Qmax2=610.08 mg/g。研究結(jié)果表明吡蟲啉分子印跡聚合物可望作為固相萃取材料對復(fù)雜樣品中吡蟲啉進(jìn)行提純和富集。

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