迪里努爾· 阿布都熱合曼，敬思群，吳珊

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046)

新疆昆侖雪菊，學名為兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria)，是菊科金雞菊屬1 年生草本植物的干燥頭狀花序，在新疆主要分布于和田地區(qū)海拔高3 000 米左右的昆侖山區(qū)，野生資源較豐富，對高血壓、高血脂、高血糖、冠心病等具有特殊療效［1］。目前，有研究［2］已從昆侖雪菊中分離鑒定出20 余類化學成分、300 多種天然成分，主要研究集中在昆侖雪菊化學成分分析［3-4］、提取物活性［5-8］，但是有關昆侖雪菊油樹脂精油成分與其抑菌作用的研究還未見報道。精油是天然產物中生物活性的一類重要組分，應用廣泛［9-11］，通常植物精油是用來制備香精、香水等。但近十多年的許多研究發(fā)現(xiàn)，精油成分具有強烈的抑制或殺死真菌等微生物的特性［12-13］。因此，本文通過GC-MS 分析了昆侖雪菊油樹脂精油化學成分，同時對昆侖雪菊油樹脂精油的體外抑菌性進行研究，旨為昆侖雪菊清熱解毒、抗菌消炎功效提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

昆侖雪菊花(野生)，由新疆和田沙漠玫瑰有限責任公司提供;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、青霉、黑曲霉，均由生命科學與技術學院微生物實驗室提供;

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;PHS-3C 實驗室PH 計，上海虹益儀器儀表有限公司;DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海-恒科技有限公司;DZF-6050 型真空干燥箱，上海-恒科技有限公司;GMSX-280 手提式壓力蒸汽消毒器，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;GHP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海-恒科學儀器有限公司;SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;QP2010 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，上海-恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 昆侖雪菊油樹脂精油的制備

昆侖雪菊花干燥粉末→超臨界CO2萃取雪菊油樹脂→3 500 r/min 離心15 min→取上清液→昆侖雪菊油樹脂精油

超臨界CO2萃取條件:萃取時間為100 min、萃取溫度為45℃、萃取壓力為20 MPa、夾帶劑(無水乙醇)用量為150 mL、CO2流量為20 L/h。

1.2.2 昆侖雪菊油樹脂精油GC-MS 成分分析

1.2.2.1 甲酯化處理

吸取3 mL 昆侖雪菊油樹脂精油于試管中，加入5 mL 石油醚和乙醚(V/V =4∶3)混合溶液，加入0.5 moL/L 氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL，振蕩，靜置10 ～15 min，加入蒸餾水，靜置分層，取上清液進樣分析。

1.2.2.2 GC-MS 實驗條件

GC 條件:色譜柱DB-5 毛細管柱(30 mm ×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度40℃，保持3 min，程序升溫10℃/min，升溫至210℃，保持2 min，程序升溫5℃/min，升溫至280℃，保持3 min。進樣口溫度280℃，柱前壓43 kPa，載氣氮氣，進樣量0.5 μL，分流比20∶1，載氣流速1 mL/min。

MS 條件:EI 離子源，源溫200℃，電子能量70 eV，連接器溫度230℃，質量掃描范圍(m/z):30 ～500。

對昆侖雪菊油樹脂精油分離，檢測，對總離子流圖中的各峰經質譜掃描后得質譜圖，將其經計算機WILEY7. LIB 威利標準譜庫數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析處理，確定樣品的組成。定量結果以GC 的峰面積計算，按峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量。昆侖雪菊油樹脂精油脂肪酸被GC 分離的各成分用下面的線性升溫公式計算其KI 值［14］:

式中:n-正烷烴的碳原子數(shù);tx-被測物質x 的保留時間，min;tn，tn+1-碳原子數(shù)相差為1 的正烷烴的保留時間(tn＜tx＜tn+1)，min。

1.2.3 昆侖雪菊油樹脂精油抑菌試驗

1.2.3.1 昆侖雪菊油樹脂精油抑菌試驗流程

制備菌懸液→倒平板→標記→涂布法接種→吸附一定劑量化學藥劑的濾紙片貼平板→倒置培養(yǎng)觀察并測量抑菌圈的直徑→數(shù)據(jù)分析總結

1.2.3.2 培養(yǎng)基的制備

細菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:稱取牛肉膏3.0 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂9 g，加蒸餾水定容至500 mL 煮沸，調pH 至7.0 ～7.2。

霉菌培養(yǎng)用馬鈴薯培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、瓊脂10 g、pH 自然(約6.0)。馬鈴薯處理方法:馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30 min(注意火力的控制，可適當補水)，用紗布過濾，濾液加糖，補足300 mL，裝入三角瓶滅菌。

1.2.3.3 菌懸液的制備

取受試細菌(霉菌)接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)18 ～24 h，取受試霉菌接種到馬鈴薯培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)產生孢子用接種環(huán)挑菌或孢子至無菌水中。

取37℃下培養(yǎng)24 h 的細菌1 環(huán)(霉菌取28℃下培養(yǎng)48 h)，接于10 mL 的無菌水中，搖勻。得到1∶10菌液。再取1∶10 菌液1 mL 至9 mL 無菌水中，得1∶100菌液。繼續(xù)稀釋，制成每毫升105～106CFU菌懸液。然后各吸取0.3 mL 分別加入已滅菌冷卻的平面培養(yǎng)基中采用稀釋涂布平板法涂布均勻后培養(yǎng)(霉菌:28℃/48 h，細菌:37℃/24 h)。

1.2.3.4 提取物的稀釋液的制備

將樣品提取物用95% 溶劑依次稀釋成75%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563% 等濃度。

1.2.3.5 濾紙片法測定昆侖雪菊油樹脂精油對細菌(霉菌)的抑菌活性

采用濾紙片法測定昆侖雪菊油樹脂對細菌(霉菌)的抑菌活性［15］。取滅菌培養(yǎng)皿，倒入10 mL 固體培養(yǎng)基，凝固作為底層，將l mL 菌懸液加入冷卻至50℃的培養(yǎng)基9 mL 中，并迅速混勻，趁熱倒5 mL 至培養(yǎng)皿，作為菌層。待菌層凝固，均勻放置依次浸潤200 μL 的0.03% 山梨酸鉀、95% 乙醇、75% 精油、50% 精油、25% 精油、12.5% 精油、6.25% 精油、3.125% 精油、1.563% 精油的滅菌濾紙片，其中0.03%山梨酸鉀和95%乙醇作為陽性對照樣，無菌生理鹽水作陰性對照。每皿做3 次重復，細菌培養(yǎng)皿置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 ～24 h，霉菌培養(yǎng)皿置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3.6 最低抑菌濃度(MIC)的測定

取100 μL 菌懸液(含菌量105～106CFU/mL)于平板中并涂布均勻，然后將培養(yǎng)基劃分成4 份，分別標注質量濃度為75%、50%、25%、12.5%、6.125%、3.125%、1.625%，取已滅菌干燥的濾紙片，貼于平板表面，每皿4 片，最后在紙片處加入相應濃度的昆侖雪菊油樹脂精油稀釋液。培養(yǎng)條件同1.2.3.5，同時設置溶劑對照，菌落被完全抑制的提取物最低稀釋濃度即為該種物質對受試菌的MIC。

2 結果與分析

2.1 昆侖雪菊油樹脂精油GC-MS 分析結果

表1 昆侖雪菊油樹脂精油GC/MS 分析結果Table 1 GC/MS analysis results of the Coreopsis oleoresin essential oil

序號 化合物名稱 含量/%序號 化合物名稱 含量/%6正己酸0.1248α-綠葉烯0.29 7月桂烯0.51491 -石竹烯0.34 8正己酸乙酯0.1350反式-α-香檸檬醇7.53 9L-香芹醇0.1151Α-姜黃烯0.64 104-甲基-1 -(1 -甲基乙基)二環(huán)［3.1.0］二脫氫己烷0.13522-氟-3-［1-羥基-2-(甲氨基)乙烷基］苯酚0.01 11鄰異丙基甲苯1.98531H-非那烯0.46 12苧烯53.3654(順)β-金合歡烯1.85 13苯乙酮0.1955異辛胺0.02 142，4-二甲基苯乙烯0.2956肉豆蔻酸0.12 15芳樟醇2.1957N-甲基-1-十八胺0.06 161，2-二羥基-3-環(huán)戊烯0.06584-氟安非他明;0.02 179-［2-［2-丁基環(huán)己烷］甲基］-環(huán)丙烷壬酸甲酯0.07593，7，11，15-四甲基已烯-1-醇(葉綠醇)0.16 181，5，5，6-四甲基-1，3 環(huán)己二烯0.1860N-甲基異丙基胺196-莰烯醇0.1761N-甲基異丙基胺0.02 204-乙?；?1-甲基-環(huán)己烯0.1462二十五烷2.65 21(1R，4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇0.2663葉綠醇0.02 22左旋樟腦0.16642-氨基十三烷0.01 23馬鞭草烯基乙基醚0.1365(R)-(-)-1-環(huán)己基乙胺0.02 242-異丙基-5-甲基-4-己烯醛0.1166D-氨基丙醇25鄰甲基苯乙酮0.4367棕櫚酸1.64 26萘0.268棕櫚酸乙酯0.21 27L-紫蘇醇0.28692，3-二甲基十七烷0.14 285-甲基-2，3 -二氮雜雙環(huán)［2.2.1］庚-2 -烯0.44708-1＇-2＇＇-己基環(huán)丙烷基環(huán)丙烷基辛酸甲酯0.57 292-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己酮0.1171合金歡醇0.03 30菊油環(huán)酮0.1372亞油酸2.2 312-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)丙醛0.43732-甲基十六醛0.13 322-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇0.08742-［［2-［(2-乙基環(huán)丙基)甲基］環(huán)丙基］甲基］環(huán)丙基辛酸甲酯0.25 332-異丙基-5-甲基茴香醚0.2675硬脂酸乙酯0.12 34L-香芹酮0.1976二十七烷0.21 35紫蘇醛0.2777二十一烷0.36 36(1，7，7-三甲基降冰片烷-2-YL)乙酸0.1278二十八烷4.04 37草蒿腦0.1179正三十烷1.15 382，5-二甲氧基-4-(甲基磺?；?苯丙胺0.01804-異丙基-1-甲基-2-環(huán)己烯-1-醇0.34 391，3-二甲基丁胺811-金剛烷乙胺4010-羥去甲替林0.0182異辛胺411R，4R，7R，11R-1，3，4，7-四甲基三環(huán)0.26833，3 -二甲基-4-(甲氨基)-2-丁酮42(+)-γ-古蕓烯4.1384羥基脲0.02

由表1 可知，以峰面積歸一化法分析各個組分的相對含量，從超臨界流體萃取的昆侖雪菊油樹脂精油中鑒定出84 種化合物，其中，含量最高的是苧烯，較高的是1，2-二羥基-3-環(huán)戊烯、鄰異丙基甲苯、(-)-乙?；?L-酒石酸、L-香芹酮、(+)-γ-古蕓烯、反式-α-香檸檬醇、β-金合歡烯、葉綠醇、亞油酸、二十八烷、正三十烷、二十五烷。張彥麗等［8］通過GC-MS 對昆侖雪菊揮發(fā)油成分進行了研究，鑒定出其主要成分也為苧烯(63.23%)，但采用的揮發(fā)油提取技術是蒸餾提取法，技術路線與本文沒有相同之處。

2.2 抑菌試驗結果分析

2.2.1 昆侖雪菊油樹脂精油對細菌和霉菌的抑制作用

由表2 可知，昆侖雪菊油樹脂精油對3 種細菌和2 種霉菌均有抑制作用。對細菌的抑制作用表明:金雞菊油樹脂精油對細菌的抑制作用均較強，且金雞菊油樹脂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用強于對枯草桿菌的抑制作用;對霉菌的抑制作用表明:金雞菊油樹脂精油對青霉的抑制作用明顯高于對黑曲霉的抑制作用。隨著提取物濃度的增加，其對所研究作用物的抑制作用相應增強。

表2 昆侖雪菊油樹脂精油的抑菌作用Table 2 Antibacterial activity of the Coreopsis oleoresin essential oil

2.2.2 昆侖雪菊油樹脂精油對細菌和霉菌最低抑制濃度的測定

由表3 可知，昆侖雪菊油樹脂精油對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值為25%，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MIC 值為50%和75%，對革蘭氏陽性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌。昆侖雪菊油樹脂精油青霉的MIC 值為50%;而黑曲霉的MIC 值為75%。昆侖雪菊油樹脂精油對不同菌的最低抑制濃度不同，但總體上對細菌的抑制最低濃度要低于真菌最低濃度。

表3 昆侖雪菊油樹脂精油的MIC 試驗結果Table 3 Result of MIC of the Coreopsis oleoresin essential oil

通過昆侖雪菊油樹脂精油成分分析結果，可以看出昆侖雪菊油樹脂精油中，含量較豐富的酯類:棕櫚酸乙酯、烷基辛酸甲酯、硬脂酸乙酯、乙酸橙花酯。因為化學結構的差異，酯類物質可能有抑制微生物的作用。

不同提取方法對油樹脂精油的MIC 也有很大影響。不同提取方法影響油樹脂精油的活性成分、純度及濃度，從而影響抑菌效果。該實驗采用超臨界流體萃取法提取油樹脂精油，易受萃取時間、萃取壓力等因素影響，其結果可能會造成精油活性成分析不全和有效成分流失。

3 結論

從昆侖雪菊油樹脂精油中共鑒定出84 個化合物，其中烯類(64.12%)、醇類(11.47%)、烷烴類(8.76%)、酸類(6.31%)、酯類(1.5%)，含量占總量的92.16 %。昆侖雪菊油樹脂精油對細菌、霉菌有一定的抑制效果。昆侖雪菊油樹脂精油對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值為25%，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、青霉和黑曲霉的MIC 值分別為50%、75%、50%和75%。

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