陳保華，毛 英，黃 榮，高 毅

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

目前，世界上廣泛采用的組織器官灌注保存液為UW(University of Wisconsin)液，它可有效地保存肝臟24～30 h，然而UW液也存在著不足，如價(jià)格昂貴等。我國(guó)上海研制并已廣泛運(yùn)用于國(guó)內(nèi)腎移植灌洗保存的高滲枸櫞酸鹽嘌呤(HCA)液，雖具有配方簡(jiǎn)便，價(jià)格合理的優(yōu)點(diǎn)，但用于移植肝的灌洗保存效果與UW液仍有較大差距。本實(shí)驗(yàn)旨在通過用漢防己甲素(TET)乳酸林格液、TET-HCA液、HCA液和UW液低溫灌洗保存供肝2 h的實(shí)驗(yàn)，比較TETHCA液與UW液對(duì)供肝的保護(hù)作用，并分析TET對(duì)HCA液的優(yōu)化效果。

1 材料與方法

1.1 材料 采用成年健康SD大鼠80只，雌雄不拘，體重(250±10)g，由中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，等級(jí)SPF〔合格證號(hào) NO：0034376，許可證號(hào) SCXK(滬)2009-0006〕，隨機(jī)分成4組。試劑有TET(江西銀濤藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、HCA液(上海輸血技術(shù)有限公司生產(chǎn))、UW液(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院提供)、乳酸林格液、ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品(南京華東醫(yī)藥公司提供)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑、乳酸脫氫酶(LDH)試劑(上海長(zhǎng)征試劑公司產(chǎn)品)。主要儀器有Waters1275型高效液相色譜儀(美國(guó)沃斯特公司)、HITACHI7150型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)、常規(guī)配制TET/乳酸林格液(60 mg/L)、TET/HCA液(60 mg/L)等。

1.2 方法

1.2.1 分組 將80只SD大鼠隨機(jī)分成4組。A組(TET乳酸林格液組)以4℃ TET乳酸林格液(70 mg/L)進(jìn)行供肝灌洗再以該液保存。B組(HCA液組)以4℃ HCA液進(jìn)行供肝灌洗再以該液保存。C組(TET-HCA液組)以4℃ TET-HCA液(60 mg/L)進(jìn)行供肝灌洗再以該液保存。D組(UW液組)以4℃UW液進(jìn)行供肝灌洗再以該液保存。每組灌洗液均為40 ml，低溫保存時(shí)間均為2 h。

1.2.2 處理方法 實(shí)驗(yàn)前12 h動(dòng)物禁食，自由進(jìn)水，乙醚麻醉后取仰臥位，腹部弧形切口，順時(shí)針分離肝下腔靜脈、右腎靜脈、右三角韌帶及鐮狀韌帶，結(jié)扎左膈靜脈，肝動(dòng)脈結(jié)扎離斷，游離出門靜脈遠(yuǎn)端并予結(jié)扎，然后經(jīng)門靜脈插管并以持續(xù)滴注法將4℃的各保存液行供肝原位低壓重力灌洗。同時(shí)剪開肝下腔靜脈，邊灌注邊放血，至肝顏色變淡呈均勻土黃色，即于4℃的各保存液中保存2 h。

1.3 標(biāo)本收集及測(cè)試方法

1.3.1 ALT及LDH檢測(cè) 分別取各組的保存液2 ml進(jìn)行檢測(cè)。取保存液前，用注射器抽取5 ml保存液，緩慢沖洗肝臟，然后將保存液搖勻取樣。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT與LDH。

1.3.2 肝組織中ATP、ADP、AMP含量測(cè)定 標(biāo)本處理：各組大鼠均取肝組織約1 g液氮中保存。標(biāo)本從液氮中取出后，迅速稱取500 mg，置于1 ml 0.4 mol/L HClO4溶液中研磨5～8 min(冰溶)，低溫離心(離心半徑8 cm，10000 r/min)15 min，取上清液；用0.6 mol/L KOH中和使pH值為7.0，再次低溫離心(離心半徑8 cm，10000 r/min)15 min，取上清液于-30℃下保存，2周內(nèi)檢測(cè)。采用waters1275型高效液相色譜檢測(cè)高能磷酸化合物，應(yīng)用C18分析柱，磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相(pH=6.0)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速 1.0 ml/min，進(jìn)樣 10μl，柱溫 23 ℃。本實(shí)驗(yàn)采用Athinson能量?jī)r(jià)(energy charge，EC)公式［EC=(ATP+1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP)］評(píng)價(jià)各組組織的能量消耗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有結(jié)果均采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

A組與B組ATP及EC值無明顯差異(P＞0.05)，提示用TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細(xì)胞能量的消耗，保持供肝細(xì)胞的活性方面具有與HCA液相當(dāng)?shù)男Ч?。C組肝細(xì)胞的ATP及EC值顯著比B組高，具有顯著性差異(P＜0.05)，提示用TET-HCA液低溫灌洗保存供肝2 h比以HCA液灌洗保存供肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細(xì)胞能量的消耗，保持供肝細(xì)胞的活性方面具有更好的效果。C組與D組中ATP及EC值無明顯差異(P＞0.05)，提示用TET+HCA液低溫灌洗保存鼠肝2 h，在減少供肝低溫灌注保存中肝細(xì)胞能量的消耗，保持供肝細(xì)胞的活性方面具有與UW液相當(dāng)?shù)男Ч?表1)。A、B兩組保存液中ALT、LDH比較無顯著差異(P＞0.05)，說明用TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2h，在供肝低溫灌注保存減少肝細(xì)胞損害方面具有與HCA液類似的效果。C組肝細(xì)胞ALT及LDH檢測(cè)值顯著較B組低，具有顯著性差異(P＜0.05)，提示用TET-HCA液低溫灌洗保存供肝2 h比以HCA液灌洗保存供肝2 h，在供肝低溫灌注保存減輕肝細(xì)胞損害方面具有更好的效果。C、D兩組ALT、LDH比較無顯著差異(P＞0.05)，表明用TETHCA液低溫灌洗保存鼠肝2 h，在供肝低溫灌注保存減少肝細(xì)胞損害方面具有與UW液相同的效果(表2)。

3 討論

供肝保存是肝移植成功的先決條件，目前常用供肝保存液中，UW液使肝臟保存由原來的6～8 h延長(zhǎng)至24～30 h，成為目前應(yīng)用最廣的肝、腎、胰臟的“金標(biāo)準(zhǔn)”保存液［1］，該保存液基本可防止細(xì)胞的水腫、細(xì)胞內(nèi)的酸中毒、間質(zhì)水腫及氧自由基的損傷，促進(jìn)了高能化合物的再生。但它也有諸如黏度高、價(jià)格昂貴、處理與檢測(cè)不便等缺點(diǎn)。

本研究表明，TET在低溫灌洗保存條件下減輕肝細(xì)胞的損害，直接用于供肝低溫灌注保存對(duì)大鼠肝臟具有良好的保護(hù)作用。推測(cè)TET應(yīng)用于配制供肝保存液可能有較好的效果。

本實(shí)驗(yàn)表明，用自行配制的TET乳酸林格液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，在供肝低溫灌注保存中可減少肝細(xì)胞能量的消耗，保持供肝細(xì)胞的活性，在減輕肝細(xì)胞損害方面具有與HCA液相當(dāng)?shù)男ЧCA液是一不含Ca2+拮抗劑的仿細(xì)胞內(nèi)保存液，其主要作用為溶液的高滲性防止了細(xì)胞的水腫；而TET主要是通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+拮抗作用而保護(hù)供肝［2-4］。本研究中兩者均具有相同的保存效果，推測(cè)供肝在低溫灌注保存中的損傷原因及保護(hù)機(jī)制可能亦具有多樣性。注：與B組比較，*P＜0.05

表1 各組肝組織中高能磷酸化合物含量比較(nmol/g，)

表1 各組肝組織中高能磷酸化合物含量比較(nmol/g，)

組別 n ADP AMP ATP EC(值)A組 20 1.242±0.155 0.943±0.100 1.346±0.199 0.571±0.1070±0.110 C組 20 1.834±0.220 0.685±0.103 1.988±0.212* 0.871±0.120*B組 20 1.370±0.210 0.917±0.121 1.485±0.241 0.612±0.104 D組 20 1.885±0.289 0.621±0.102 2.043±0.301 0.89

表2 各組保存液中ALT、LDH的含量比較(U/L，)

表2 各組保存液中ALT、LDH的含量比較(U/L，)

注：與B組比較，*P＜0.05

組別 n ALT LDH A組20 10.6±5.01 150.1±70.4020 23.5±6.11 242.4±75.20 B組 20 24.1±5.24 239.8±71.91 C組 20 11.5±4.98* 148.3±69.70*D組

本實(shí)驗(yàn)C組肝細(xì)胞的ALT及LDH含量顯著較B組低，ATP及EC值顯著較B組較高，均具有顯著差異(P＜0.05)；提示用TET-HCA液低溫灌洗并保存鼠肝2h，在減少肝細(xì)胞的能量消耗，保持供肝細(xì)胞的活性，減輕肝細(xì)胞損害方面具有比HCA液更好的效果，表明在低溫灌洗保存條件下保存大鼠供肝時(shí)，TET對(duì)HCA液具有積極的優(yōu)化作用。其原因可能與TET具有鈣離子拮抗及氧自由基清除雙重作用，彌補(bǔ)了HCA液不含鈣拮抗劑的不足，兩者產(chǎn)生了互補(bǔ)和(或)協(xié)同作用。

在冷保存期間影響器官活力的主要因素為灌注損傷、溶酶體酶釋放、線粒體功能障礙、細(xì)胞水腫及氧自由基形成等［5］。本實(shí)驗(yàn)用TET-HCA液低溫灌洗并保存鼠肝2 h，對(duì)供肝的保護(hù)作用具有與UW液類似的較好效果。推測(cè)可能與下列因素有關(guān)［6-9］：①TET能穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，保護(hù)細(xì)胞膜通透性，可明顯抑制LDH的釋放和保護(hù)高能磷酸化合物，使肝細(xì)胞損害減輕，提高肝細(xì)胞活性；②能降低炎癥反應(yīng)減輕組織水腫，可能與其降低炎癥組織細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平有關(guān)，因?yàn)樵谘装Y反應(yīng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的Ca2+升高可引起內(nèi)皮細(xì)胞收縮，引起毛細(xì)血管通透性增加；③TET可減少自由基的產(chǎn)生和糾正超氧化物歧化酶(SOD)的生成不足。自由基是生物體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的具有強(qiáng)氧化活性的物質(zhì)，自由基的大量產(chǎn)生，超過抗氧化系統(tǒng)的承受能力，可引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA分解等病理變化［10］。同樣，亦有文章提出［11-12］，在移植腎缺血再灌注損傷的病理生理過程中，活性氧對(duì)腎組織的損傷作用是腎組織病變機(jī)制之一，甚至是許多因素?fù)p傷腎組織的最終遞質(zhì)?？傊瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果的差異和機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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