鄭建輝，張炫輝，李國琴，鄧 悅，陳曉萍，李國華

（1．浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州310014；2．浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州310014）

生物材料的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)于20世紀(jì)60年代首先由美國國立衛(wèi)生研究院建立，主要用于評價(jià)生物材料植入體內(nèi)后血液成分對其的適應(yīng)性［1］。血液相容性評價(jià)包括溶血和凝血性質(zhì)兩方面［2］。溶血是指紅細(xì)胞溶解、血紅蛋白釋放的現(xiàn)象，而凝血是指血漿凝固的過程，涉及到多種血漿成分、血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)一種生物材料與血液接觸時(shí)，其表面的理化性質(zhì)以及形貌特征是影響血液相容性的主要因素［3－5］。

TiO2納米顆粒具有獨(dú)特的物理、化學(xué)與生物特性，在化妝品、食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有著潛在的廣泛應(yīng)用前景。因此，近年來其生物相容性受到越來越多的關(guān)注。血液是機(jī)體的運(yùn)輸系統(tǒng)，血液相容性是生物相容性評價(jià)的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TiO2納米顆?？梢鹧?xì)胞沉積、血液凝集以及紅細(xì)胞溶血［6］，這種血液特性與 TiO2納米顆粒的表面特征有關(guān)［7，8］。

作者在此對自制金紅石TiO2納米顆粒與市售P25TiO2納米顆粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，然后采用兩種常規(guī)的血液相容性研究方法——紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)與血漿復(fù)鈣時(shí)間（PRT）測定，分析比較了這兩種TiO2納米顆粒的血液相容性特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

四氯化鈦（98．0%），上海美星化工試劑有限公司；P25TiO2納米顆粒，德國Degussa公司；新鮮綿羊抗凝血，金華利民檢驗(yàn)試劑經(jīng)營部。

X′Pert PRO型 X－射線衍射儀，荷蘭PANalytical公司；Tecnai G2F30S－Twin型300kV高分辨透射電鏡，荷蘭Philips－FEI公司；UV1000型紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1．2 金紅石TiO2納米顆粒的制備

利用自有專利技術(shù)（ZL200410084338．6）采用水凝膠方法制備金紅石TiO2納米顆粒，具體過程如下：首先于0～10℃將100mL四氯化鈦液體緩慢滴入200mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笮纬蓽\黃綠色溶膠；溶膠在室溫下放置老化24～48h后，取50mL溶膠放入三角燒瓶，在0～40℃下滴加去離子水，充分?jǐn)嚢栊纬蔁o色透明溶液；所得溶液于40℃繼續(xù)攪拌0．5～1h，升溫至60℃維持0．5～1h，最后將體系升溫至95℃，攪拌回流2h后靜置沉淀；過濾，沉淀物經(jīng)去離子水洗滌、80℃干燥，即得金紅石TiO2納米顆粒。

1．3 納米材料的結(jié)構(gòu)表征

X－射線衍射測試采用 Cuκα 射線（λ＝0．1541 nm），電壓40kV，電流40mA，步長0．033°，范圍20°～75°；HRTEM微結(jié)構(gòu)表征采用高分辨透射電鏡。在進(jìn)行HRTEM測試之前，將樣品超聲分散在無水乙醇中，吸取上清液滴至Cu網(wǎng)，干燥。

1．4 血漿復(fù)鈣時(shí)間的測定

血漿復(fù)鈣時(shí)間的測定參照文獻(xiàn)［9，10］。具體步驟如下：（1）取10mL新鮮綿羊抗凝血，以3000r·min－1離心20min，小心吸取上清液，即為乏血小板血漿（Platelet－poor plasma，PPP）；（2）以生理鹽水將金紅石與P25TiO2納米顆粒配成20mg·mL－1的懸液，超聲分散1h，121℃ 滅菌30min得納米儲備液；（3）以生理鹽水將金紅石和P25納米儲備液配成0mg·mL－1、1mg·mL－1、2mg·mL－1、3mg·mL－1、4mg·mL－1、5mg·mL－1、6mg·mL－1的溶液，超聲分散1h，得納米懸浮液；（4）將納米懸浮液以2500r·min－1離心10min，吸取上清液，得納米浸出液；（5）取2．5cm×7．5cm潔凈載玻片，加入100μL PPP、100 μL納米懸浮液或浸出液、100μL 0．025mol·mL－1CaCl2溶液，混勻，37℃孵育，立即計(jì)時(shí)，每隔30s以不銹鋼注射器針頭挑動混合液，當(dāng)針頭上出現(xiàn)纖維沉淀時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。

1．5 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)

通過檢測靜態(tài)條件下紅細(xì)胞中血紅蛋白的釋放評價(jià)紅細(xì)胞溶血程度［11］。具體步驟如下：（1）取新鮮綿羊抗凝血6mL置于10mL離心管中，以2500r·min－1離心10min，棄上清液。沉淀的紅細(xì)胞用生理鹽水反復(fù)洗滌2～3次，至離心后上清液無色。將所得的紅細(xì)胞用生理鹽水配成2%的紅細(xì)胞懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用時(shí)搖勻；（2）將金紅石與P25納米儲備液以生理鹽水配成0mg·mL－1、0．4mg·mL－1、0．8mg·mL－1、1mg·mL－1、2mg·mL－1、3mg·mL－1、4mg·mL－1的納米使用液，取2mL納米使用液，加入2mL紅細(xì)胞懸液，混勻后成為溶血測試液；（3）溶血測試液分別進(jìn)行紫外激發(fā)和無紫外激發(fā)兩種處理。紫外激發(fā)組溶血測試液先用波長280nm的紫外燈照射2h，然后放入37℃的電熱恒溫水浴鍋中孵育4h。無紫外激發(fā)組溶血測試液先于室溫下靜置2h，再和紫外激發(fā)組一起于37℃孵育4h。孵育后的溶液以2500r·min－1離心10min，小心吸取上清液，用紫外可見分光光度計(jì)測定545nm波長下的吸光度，測定時(shí)用生理鹽水調(diào)零，以去離子水加等量紅細(xì)胞懸液作為陽性對照；（4）溶血率計(jì)算公式：溶血率＝（樣品管OD值／陽性對照管OD值）×100%。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

定量測定中每個(gè)樣本重復(fù)測定5次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差）表示，t－Student方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0．05為顯著性差異、P＜0．01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2．1 金紅石與P25TiO2納米顆粒的XRD分析（圖1）

圖1 金紅石和P25TiO2納米顆粒的XRD圖譜Fig．1 XRD Patterns of rutile and P25TiO2nanoparticles

從圖1可以看出，金紅石TiO2納米顆粒在衍射角2θ＝27．446°、d＝0．3247nm處出現(xiàn)最明顯的衍射峰，其次分別在2θ＝36．085°、d＝0．2487nm 和2θ＝54．322°、d＝0．1687nm 處出現(xiàn)較明顯的衍射峰，分別屬于金紅石相的（101）、（110）、（211）晶面（PDF＃21－1276）。表明所制備的納米TiO2晶型為純金紅石相。P25TiO2納米顆粒在2θ＝25．281°、d＝0．352nm（PDF＃21－1272）和2θ＝27．446°、d＝0．3247nm處有較明顯的衍射峰，但銳鈦礦相的衍射峰峰面積比金紅石相的大，證實(shí)其組成為80%～75%銳鈦礦相和20%～25%金紅石相。

2．2 金紅石與P25TiO2納米顆粒的HRTEM分析

圖2為兩種TiO2納米顆粒的高分辨透射電鏡（HRTEM）照片。

從圖2a、b可以看出，金紅石TiO2納米顆粒呈多面體形狀，粒徑20～60nm，其晶格條紋清晰，相鄰的晶格間距為0．32nm，與金紅石相的主晶面（101）（0．3247nm，PDF＃077－0441）接近。從圖2c可以看出，P25TiO2納米顆粒也呈多面體形狀，粒徑15～50 nm，與金紅石TiO2納米顆粒相近，但P25的晶形不如金紅石規(guī)整，粒徑分布較廣，這可能是由于晶體的多面體畸變程度以及相互連接方式不同所致。

2．3 金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿凝集的影響

金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響見圖3。

從圖3可以看出，在0．4～4．0mg·mL－1范圍內(nèi)，無論是采用懸浮液還是浸出液，兩種TiO2納米顆粒都沒有引起血漿復(fù)鈣時(shí)間的改變，相互之間也沒有顯著的差異（P＞0．05）。表明金紅石與P25TiO2納米顆粒對血漿凝集無明顯影響。

2．4 金紅石與P25TiO2納米顆粒對紅細(xì)胞溶血活性的影響

金紅石與P25兩種TiO2納米顆粒對紅細(xì)胞溶血活性的影響如圖4所示。

圖4 金紅石（a）和P25（b）TiO2納米顆粒對紅細(xì)胞溶血活性的影響Fig．4 Effects of rutile（a）and P25（b）TiO2nanoparticles on hemolytic activity

從圖4可以看出，在低劑量（≤0．8mg·mL－1）作用下，兩種TiO2納米顆粒對紅細(xì)胞溶血率無明顯影響（P＞0．05）；當(dāng)作用劑量為1．0～4．0mg·mL－1時(shí)，如不經(jīng)紫外線激發(fā)，金紅石與P25TiO2納米顆粒對紅細(xì)胞溶血活性仍無明顯影響，但經(jīng)紫外線處理后的TiO2納米顆粒引起了輕度的紅細(xì)胞溶血。

2．5 討論

關(guān)于TiO2納米顆粒的血液相容性近年來受到了許多關(guān)注，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為，納米TiO2是生物安全度高的生物材料，如使用超疏水TiO2納米管進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)未引起明顯的溶血現(xiàn)象［11］；陳效等［12］用 TiO2納米溶膠進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)也未引起溶血現(xiàn)象，通過尾靜脈注射TiO2納米顆粒到小鼠體內(nèi)，凝血時(shí)間無明顯改變；但Li等［6］在以TiO2納米顆粒與紅細(xì)胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)納米顆粒引起紅細(xì)胞聚集與沉淀，并出現(xiàn)輕度溶血。

TiO2納米顆粒的表面特性會影響其血液相容性，如覆蓋于拋光Ti表面的網(wǎng)絡(luò)狀TiO2納米顆粒誘導(dǎo)血小板聚集與活化［8］，表面包覆TiO2的鎳鈦合金導(dǎo)致血液凝集能力降低［13］，摻Gd3＋的無定形TiO2納米顆粒具有較高的生物相容性［14］，摻磷的金紅石TiO2晶體的血液相容性得到改善［15］，摻磷納米TiO2薄膜的血液相容性也發(fā)生了改變［16］。

本研究用TiCl4制備的金紅石TiO2納米顆粒與P25TiO2納米顆粒粒徑相近，但純度、晶體規(guī)整性與粒徑均勻度不同。從紅細(xì)胞溶血和凝血實(shí)驗(yàn)來看，兩種納米顆粒僅在高濃度作用同時(shí)伴有紫外激活條件下才會引起溶血率輕度升高，對血漿復(fù)鈣時(shí)間沒有明顯的影響。由于納米材料的生物相容性涉及敏感的生態(tài)安全性問題，對這種輕微溶血現(xiàn)象仍需加以進(jìn)一步的關(guān)注。

3 結(jié)論

不同TiO2納米顆粒的血液相容性具有差別。采用高分辨透射電鏡和X－射線衍射儀對自制金紅石TiO2納米顆粒和市售P25TiO2納米顆粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并研究了這兩種納米顆粒對紅細(xì)胞溶血活性與血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響。結(jié)果表明，兩種TiO2納米顆粒都具有很好的血液相容性，在一定劑量范圍內(nèi)不引起紅細(xì)胞溶血和凝血現(xiàn)象，但金紅石與P25TiO2納米顆粒在濃度大于1．0mg·mL－1的高劑量下伴以紫外線激發(fā)后可造成輕微的溶血現(xiàn)象。這種輕微溶血現(xiàn)象需引起納米材料生物相容性評價(jià)的關(guān)注。

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