滿永博，范季瀛，蘇 剛，饒 犇，沈亞領(lǐng)（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 魯華生物技術(shù)研究所，上海200237）

乳酸［1－4］是一種重要的有機(jī)酸，是合成多種物質(zhì)的基礎(chǔ)原料，同L－乳酸相比，D－乳酸的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更大，除應(yīng)用在醫(yī)藥、日化和化學(xué)工業(yè)外，其更重要的應(yīng)用價(jià)值體現(xiàn)在可以改良聚乳酸特性［5］，提升其熔點(diǎn)并延長降解時(shí)間。高光學(xué)純度D－乳酸市場需求量大且價(jià)格昂貴，有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，化學(xué)合成法生產(chǎn)D－乳酸存在諸如工藝復(fù)雜、成本高、聚合物光學(xué)純度低等缺點(diǎn)［6］；生物催化法原料昂貴且應(yīng)用范圍??；發(fā)酵法［7］生產(chǎn)D－乳酸是較好的生產(chǎn)工藝，多數(shù)細(xì)菌代謝途徑中存在葡萄糖代謝生成乳酸的途徑，且發(fā)酵工藝的原料來源廣泛、價(jià)格低廉［8］，具有廣闊的應(yīng)用前景。工業(yè)生產(chǎn)高光學(xué)純度D－乳酸的菌株大多為乳酸菌屬，該菌屬乳酸產(chǎn)量高，但其培養(yǎng)基成分復(fù)雜、培養(yǎng)條件苛刻，因而生產(chǎn)成本較高［9］。因此，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組分［10］，獲得廉價(jià)、高效的培養(yǎng)基配方具有現(xiàn)實(shí)意義。

與乳酸菌屬相比，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）［11］培養(yǎng)條件要求較低，培養(yǎng)基組分相對(duì)簡單、廉價(jià)，在轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率上具有優(yōu)勢。作者首次選用粘質(zhì)沙雷氏菌作為乳酸生產(chǎn)菌，考察了其培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分對(duì)菌體生長及D－乳酸產(chǎn)量的影響，擬為深入研究其代謝途徑［12，13］及產(chǎn)物提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 菌株

重組粘質(zhì)沙雷氏菌 R1（Serratia marcescens R1，KnR，α－乙酰乳酸合成酶基因缺失），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，甘油懸液保藏法保存于－80℃冰箱。

1．2 方法

（1）菌株活化：取1mL菌液接種至裝液量為50 mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，置于28℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h。取適量菌體稀釋后涂布于種子培養(yǎng)基平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h至長出單菌落。

（2）種子培養(yǎng)：從固體培養(yǎng)基平板上挑取生長良好的單菌落接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，加入適量卡那霉素以防止染菌，置于28℃、200 r·min－1搖床培養(yǎng)12h，得種子培養(yǎng)液。如有需要，再次轉(zhuǎn)接種子制成二級(jí)種子培養(yǎng)液備用。

（3）搖瓶發(fā)酵：按照5%接種量，轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)液至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，加入適量卡那霉素防止染菌，分兩階段培養(yǎng)：第一階段28℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h左右；其后，調(diào)節(jié)適合溫度靜置厭氧培養(yǎng)產(chǎn)酸，添加軟性碳酸鈣或4mol·L－1堿液維持一定pH值。

1．3 分析測試

1．3．1 葡萄糖濃度測定

取適量培養(yǎng)上清液稀釋N倍后振蕩混勻，使其葡萄糖濃度在1g·L－1左右。取兩支試管，各加入葡萄糖試劑1mL后，分別加入10μL校準(zhǔn)液及待測液于試管中，37℃水浴10min后，用1．0cm比色杯（用空白管調(diào)零點(diǎn)），于505nm處測定其吸光度值，校準(zhǔn)液記為A0，待測液記為A。按式（1）計(jì)算上清液葡萄糖濃度S（g·L－1）：

1．3．2 菌體濃度的測定

取微量不同生長階段的菌液，適當(dāng)稀釋N倍使得其吸光度值A(chǔ)處于0．2～0．8范圍內(nèi)，測其在600nm處的吸光度值。菌體濃度OD600＝A×N，根據(jù)干重標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為菌體干重。

1．3．3 乳酸濃度測定

采用島津高效液相色譜儀測定發(fā)酵液中乳酸濃度。

色譜 條 件：Bio－Rad Aminex HPX－87H 色 譜 柱（300mm×7．8mm）；流動(dòng)相5mmol·L－1H2SO4；流速0．6mL·min－1；進(jìn)樣量50μL；柱溫65℃。

液相色譜法測定結(jié)果為總?cè)樗釢舛?，采用乳酸試劑盒法?zhǔn)確測定各對(duì)映體構(gòu)型乳酸濃度，同時(shí)與液相色譜法的測定結(jié)果進(jìn)行比較。測定原理如下［14］：

由上述反應(yīng)式可知，NADH的生成量與乳酸的量等摩爾，NADH的量可以通過測定其在340nm處吸光度值的變化量ΔA獲得。

按c＝0．3204×ΔA分別計(jì)算出L－乳酸和D－乳酸的濃度，則光學(xué)純度POptical按式（2）計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2．1 培養(yǎng)條件的確定

2．1．1 培養(yǎng)溫度、pH 值的影響

細(xì)菌厭氧發(fā)酵有機(jī)酸過程中，隨著厭氧培養(yǎng)的進(jìn)行，菌體所消耗糖類轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，后者的積累會(huì)致使培養(yǎng)環(huán)境中的pH值降低，抑制菌體胞內(nèi)有機(jī)酸代謝過程中關(guān)鍵酶的活性，降低菌體利用基質(zhì)的速率并改變菌體細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)等，對(duì)目的產(chǎn)物的生成造成不利影響?？疾炫囵B(yǎng)溫度及pH值對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 培養(yǎng)溫度（a）和pH值（b）對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響Fig．1 Effects of culture temperature（a）and culture pH value（b）on biomass and lactic acid yield

由圖1a可知，培養(yǎng)溫度在28～34℃范圍內(nèi)，菌體量、乳酸產(chǎn)量均隨培養(yǎng)溫度升高而增大，超過34℃后，菌體量、乳酸產(chǎn)量均急劇下降。同時(shí)，菌體在相對(duì)低培養(yǎng)溫度條件下的耗糖量更大。從菌體生長方面考慮，應(yīng)該控制培養(yǎng)溫度低于34℃，此時(shí)，菌體量大且殘?zhí)橇康徒趿恪Ｒ虼?，選擇培養(yǎng)溫度為34℃。

由圖1b可知，偏堿性（pH值＞7．5）培養(yǎng)條件和偏酸性（pH值＜6．5）培養(yǎng)條件下的乳酸產(chǎn)量和菌體量均低于近中性條件，且堿性培養(yǎng)條件需要中和劑維持，增加成本。在粘質(zhì)沙雷氏菌生長及代謝過程中，近中性（pH值7．5～6．5）培養(yǎng)條件下，乳酸產(chǎn)量及菌體量均較大。但pH值6．5培養(yǎng)條件可以減少中和劑的加入，降低成本。因此，選擇pH值為6．5。

2．1．2 溶氧的影響

粘質(zhì)沙雷氏菌作為兼性好氧菌，在有氧及無氧條件下均可以生長，但在無氧條件下發(fā)酵生成乳酸。搖瓶實(shí)驗(yàn)中的溶氧狀況和載液量相關(guān)，載液量的增加意味著溶氧及傳質(zhì)速率的下降?？疾燧d液量對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 載液量對(duì)菌體量和乳酸產(chǎn)量的影響Fig．2 Effects of loaded liquid on biomass and lactic acid yield

由圖2可知，隨著載液量的增加，乳酸產(chǎn)量和菌體量均增大，載液量為150mL／500mL時(shí)，乳酸產(chǎn)量最大，達(dá)10．35g·L－1；但載液量超過150mL／500mL后，乳酸產(chǎn)量略微下降，而菌體量急劇下降。50mL／500mL裝液量下，原本最利于氧的傳遞及菌體的生長，但總營養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)偏少，其菌體量及乳酸產(chǎn)量較低。因此，選擇載液量為150mL／500mL。

2．2 培養(yǎng)基的確定

2．2．1 碳、氮源的選擇［15］（圖3）

圖3 碳源（a）和氮源（b）對(duì)菌體量及乳酸產(chǎn)量的影響Fig．3 The effects of carbon sources（a）and nitrogen sources（b）on biomass and lactic acid yield

由圖3a可知，菌株的碳源譜較廣，可利用多種碳源。其中以葡萄糖、蔗糖和乳糖為碳源的菌體量及乳酸產(chǎn)量均優(yōu)于甘油、淀粉和纖維素水解液。葡萄糖相對(duì)廉價(jià)，作為碳源培養(yǎng)微生物，菌體生長迅速且代謝途徑清楚，利于分析代謝過程及計(jì)算生長過程中的參數(shù)，是有機(jī)酸發(fā)酵比較常用的碳源。因此，選擇葡萄糖作為碳源。

由圖3b可知，菌株可利用多種氮源，其中有機(jī)氮源如酵母粉、蛋白胨、花生餅粉和尿素的菌體量要高于磷酸氫二銨（DAP）和檸檬酸銨（Atc），且蛋白胨、酵母粉為氮源時(shí)的乳酸產(chǎn)量較高。因此，選擇酵母粉作為氮源。

綜上，選擇葡萄糖和酵母粉作為碳、氮源，用量較大時(shí)選擇工業(yè)葡萄糖和國產(chǎn)酵母粉。

2．2．2 葡萄糖及酵母粉濃度的選擇

培養(yǎng)基中碳、氮源濃度對(duì)菌體生長及產(chǎn)物生成均有較大影響。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源濃度超過5%時(shí)，細(xì)菌會(huì)因細(xì)胞脫水而衰亡，且存在克列勃特里效應(yīng)抑制細(xì)胞的有氧呼吸產(chǎn)能。設(shè)計(jì)葡萄糖及酵母粉濃度梯度實(shí)驗(yàn)考察菌體生長狀況，搖瓶有氧培養(yǎng)16h，測定吸光度值及菌體干重，結(jié)果見圖4。

由圖4a可知，隨著葡萄糖濃度的增大，菌體量增加；葡萄糖濃度為15g·L－1時(shí)，菌體量最大；當(dāng)葡萄糖濃度超過15g·L－1后，菌體量急劇下降。低葡萄糖濃度（≤15g·L－1）下菌體生長良好，獲得較大積累。但是，過低葡萄糖濃度使得能源供應(yīng)不足，致使菌體量偏小。葡萄糖濃度在10～15g·L－1范圍內(nèi)，阻遏效應(yīng)小，菌體量能夠短期內(nèi)較多積累，因此，選擇最佳葡萄糖濃度為15g·L－1。

由圖4b可知，酵母粉濃度的增大為細(xì)菌提供足量的氮源、氨基酸、生長因子等物質(zhì)，菌體量大幅增加，但高濃度的酵母粉會(huì)致使氮源過飽和，促進(jìn)能量向菌體積累方向轉(zhuǎn)移，反而對(duì)目的產(chǎn)物生成不利。工業(yè)發(fā)酵過程中，往往對(duì)氮源，特別是碳氮比應(yīng)合理掌控，促使能夠獲得更多目的產(chǎn)物。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本、菌體生物量積累等，選擇最佳酵母粉濃度為15g·L－1。

2．2．3 磷酸鹽的選擇

磷是核酸的重要組成成分，參與細(xì)胞的多種代謝，是微生物不可或缺的營養(yǎng)成分。此外，加入磷酸鹽可起到緩沖pH值的效果。按照前述的培養(yǎng)方法，配制含磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀濃度梯度的培養(yǎng)基，搖瓶有氧培養(yǎng)16h，測定吸光度值及菌體干重，結(jié)果見圖5。

由圖5a可知，隨著K2HPO4·3H2O濃度的增大，菌體量快速增加，K2HPO4·3H2O濃度為2．0g·L－1時(shí)，菌體干重最大，為4．02g·L－1；但過多磷酸鹽的加入會(huì)使得菌體生長變慢，生物量減少。因此，選擇最佳K2HPO4·3H2O濃度為2．0g·L－1。

由圖5b可知，KH2PO4濃度為1．5g·L－1時(shí)，其菌體干重最大，為3．99g·L－1。因此，選擇最佳KH2PO4濃度為1．5g·L－1。

2．2．4 金屬離子鹽的選擇

金屬離子參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、能量轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性，是微生物正常生長和代謝過程中非常重要的一類元素。細(xì)胞內(nèi)分子成分包括Ca2＋、Mg2＋、Fe2＋，生理調(diào)節(jié)物質(zhì)如Na＋、K＋可以維持細(xì)胞滲透壓，Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋可以作為某些酶的激活劑，特殊分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)如Co2＋、Mo2＋等。因此，考察金屬離子鹽對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長及產(chǎn)物乳酸生成的影響是很有必要的。對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)中常見的金屬離子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)菌體生長的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，Mg2＋、Mn2＋、Fe2＋對(duì)菌體的生長有一定的促進(jìn)作用；Cu2＋、Co2＋有抑制作用；Zn2＋無促進(jìn)或抑制效應(yīng)。因此，進(jìn)一步考察3種金屬離子鹽濃度對(duì)菌體生長和乳酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。

圖6 金屬離子對(duì)菌體生長的影響Fig．6 Effects of metal ions on cell growth

由圖7a可知，Mg2＋作為乳酸脫氫酶激活劑可以促進(jìn)代謝產(chǎn)物乳酸的生成。在MgSO4·7H2O濃度為1．0g·L－1時(shí)，菌體量和乳酸產(chǎn)量均最大。因此，選擇最佳 MgSO4·7H2O濃度為1．0g·L－1。

由圖7b可知，當(dāng)MnSO4·H2O濃度低于5mg·L－1時(shí)，菌體量及乳酸產(chǎn)量偏低；當(dāng)濃度高于5mg·L－1時(shí)，Mn2＋影響菌體細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)進(jìn)而對(duì)菌體生長及乳酸生成不利。因此，選擇最佳MnSO4·H2O濃度為5mg·L－1。

圖7 金屬離子鹽濃度對(duì)菌體生長及乳酸產(chǎn)量的影響Fig．7 Effects of concentration of metal ion salts on cell growth and lactic acid yield

由圖7c可知，當(dāng)FeSO4·7H2O濃度為30mg·L－1時(shí)，菌體量及乳酸產(chǎn)量均最大；當(dāng)濃度低于或高于30mg·L－1時(shí)，F(xiàn)e2＋對(duì)菌體生長及產(chǎn)物積累有抑制作用。因此，選擇最佳FeSO4·7H2O濃度為30mg·L－1。

2．3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，D－乳酸產(chǎn)量由（13．5±1．29）g·L－1提高至（29．0±1．42）g·L－1，提高一倍以上，光學(xué)純度大于97%。表明通過培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到的是發(fā)酵優(yōu)化初始階段提升產(chǎn)量的較優(yōu)方案，同時(shí)也為發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)、進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝［16］提供了參考和依據(jù)。

3 結(jié)論

采用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)D－乳酸，考察了培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分對(duì)菌體生長和乳酸產(chǎn)量的影響。確定了最佳培養(yǎng)條件如下：溫度為34℃，pH值為6．5，接種量為5%，載液量為150mL／500mL，采用兩階段培養(yǎng)工藝——前期通氣有氧培養(yǎng)16h、后期厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的培養(yǎng)方案。優(yōu)化的培養(yǎng)基（g·L－1）為：葡萄糖15，酵母粉15，KH2PO41．5，K2HPO4·3H2O 2．0，MgSO4·7H2O 1．0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．03，MnSO4·7H2O 0．005。在最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，D－乳酸產(chǎn)量由（13．5±1．29）g·L－1提高至（29．0±1．42）g·L－1，產(chǎn)量提高一倍多，光學(xué)純度大于97%。

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