余 磊，韓雅莉

（1．武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢430205；2．廣東工業(yè)大學(xué)，廣東 廣州510006）

黃粉蟲（Tenebrio molitor）俗稱黃粉甲、面包蟲，原產(chǎn)于南美洲，屬于倉庫和貯藏害蟲。因其營養(yǎng)成分高，營養(yǎng)含量居各類活體動物蛋白飼料之首，被譽為“蛋白質(zhì)飼料寶庫”。作者所在課題組從黃粉蟲體內(nèi)分離純化得到黃粉蟲纖溶酶［1，2］，對其基因DNA序列進行了分析，克隆得到其中一種黃粉蟲纖溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登錄號：JN662461），并將其表達［3］。在此，利用生物信息學(xué)方法，對黃粉蟲纖溶酶序列進行多方位分析、確定活性中心的位置，建立了可靠的黃粉蟲纖溶酶三維結(jié)構(gòu)模型，并揭示了黃粉蟲纖溶酶的纖溶機理。

1 方法

要想了解蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，需要將蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶，用X－射線衍射分析蛋白質(zhì)的單晶才能完成。但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件苛刻，而且不是所有蛋白質(zhì)都能形成單晶，因此實施起來受到限制。利用現(xiàn)代計算機技術(shù)，人們可以對已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，同時還能對蛋白質(zhì)序列中的每一個氨基酸逐個分析。因此，比較蛋白質(zhì)模建，又稱同源模建，逐漸成為目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法［4－6］。

將黃粉蟲纖溶酶的序列提交到NCBI的自動比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器Blast上，通過程序，自動確定黃粉蟲纖溶酶序列活性中心與底物結(jié)合部位；將黃粉蟲纖溶酶蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入Biosun軟件，軟件自動選取蛋白質(zhì)Tryp＿SPc［cd00190］為模板，模擬得到黃粉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)，并利用Blast比較模板蛋白與黃粉蟲纖溶酶的同源性；利用Goldkey軟件，對黃粉蟲纖溶酶全序列等電點、親水性、柔性進行分析，基于無模型比對時活性中心氨基酸殘基的性質(zhì)，進一步闡明黃粉蟲纖溶酶的纖溶機理。

2 結(jié)果與討論

2．1 黃粉蟲纖溶酶序列分析（圖1）

圖1 黃粉蟲纖溶酶序列分析Fig．1 The sequence analysis of fibrinolysin fromTenebrio molitor

由圖1可知，黃粉蟲纖溶酶序列的活性中心（Active sites）為 H72、D117、S212，底物結(jié)合部位（Substrate binding sites）為：D207、S228、G230。

2．2 三維結(jié)構(gòu)模擬與評估

黃粉蟲纖溶酶的模擬三維結(jié)構(gòu)見圖2，模板蛋白和黃粉蟲纖溶酶的同源性比較見表1。

圖2 黃粉蟲纖溶酶模擬三維結(jié)構(gòu)Fig．2 The analogous 3D－structure of fibrinolysin from Tenebrio moliter

圖2中，a、b、c 3個球狀模型，分別對應(yīng)黃粉蟲纖溶酶的活性中心S212、H72、D117三個氨基酸殘基側(cè)鏈：羥基、咪唑基、羧基，與胰蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)一致［7，8］。d、e、f三處肽鍵鏈狀模型，分別對應(yīng)黃粉蟲纖溶酶的底物結(jié)合部位D207、S228、G230。由三維結(jié)構(gòu)可以看出底物結(jié)合部位和活性中心均沒有α－螺旋和β－折疊（α－螺旋為柱狀區(qū)，β－折疊為板狀區(qū)），該區(qū)域容易發(fā)生形變，在催化過程中與底物結(jié)合時，產(chǎn)生誘導(dǎo)契合，符合酶催化理論；酶活中心處于蛋白質(zhì)中心凹穴處，與通常對纖溶酶活性中心的認(rèn)識一致［9，10］。本課題組前期研究中曾發(fā)現(xiàn)黃粉蟲纖溶酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，推測其為絲氨酸蛋白酶［2，3］，此推測與生物信息學(xué)方法找到的活性中心S212相吻合。

黃粉蟲纖溶酶的序列為：MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPA－LRSYIQQTAGI。

模板蛋白序列為：IVGGSEAKIGSFPWQVSLQYTGGRHFCGGSLISPRWVLTAAHCVYSSAPSNYTVRLGSHDLSSNEGGGQVIKVKKVIVHPNYNPSTYDNDIALLKLKRPVTLSDNVRPICLPSSGYNLPAGTTCTVSGWGRTSEGGPLPDVLQEVNVPIVSNAECKRAYSYGGTITDNMLCAGGLEGGKDACQGDSGGPLVCNDNGRGVLVGIVSWGSGCARPNYPGVYTRVSSYLDWIQKT。

表1 模板蛋白和目的蛋白同源性比較Tab．1 The homology comparison between the template protein and the target protein

由表1可知，Blast評分為186，說明模板蛋白和目的蛋白的同源性比較高；序列覆蓋率達到了94%；隨機匹配的可能性非常小，僅為2E－62，說明兩個蛋白出現(xiàn)相同的序列并非偶然；最大序列的相似度達到51%。表明，以此模板蛋白進行同源模建，所得結(jié)構(gòu)是比較可信的。

2．3 Goldkey軟件的序列分析

在黃粉蟲纖溶酶三維結(jié)構(gòu)分析中，采用的是同源模建的方法。預(yù)測過程中，其它蛋白質(zhì)與目標(biāo)預(yù)測物的差異，會導(dǎo)致一定程度的偏差。采用Goldkey軟件對序列的每個殘基逐個計算其特性，雖然無法得到三維結(jié)構(gòu)，但是其數(shù)據(jù)可靠性更好，更能反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性。用Goldkey軟件分別對黃粉蟲纖溶酶氨基酸序列進行等電點模擬、親水性模擬、柔性模擬，結(jié)果見圖3。

由圖3a可知，黃粉蟲纖溶酶的等電點為9．16，在人體內(nèi)正常生理環(huán)境下，該酶帶正電。而纖維蛋白通常帶負(fù)電荷，所以黃粉蟲纖溶酶很容易靠近纖維蛋白，并與之結(jié)合。因此，黃粉蟲纖溶酶對血栓有一定的靶向作用。

對于水溶性球形蛋白，親水值較低的氨基酸，趨向于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水值較高的氨基酸，趨向于蛋白質(zhì)的外部。由圖3b可知，H72、S212、D207親水值較低，而且H72和D207是局部親水值最低點，應(yīng)該在球蛋白內(nèi)部；S228、G230親水值較高，應(yīng)該在球蛋白外部，與三級結(jié)構(gòu)相符。

圖3 等電點模擬（a）、親水性模擬（b）和柔性模擬（c）Fig．3 The isoelectric point analogue（a），hydrophilicity analogue（b）and flexibility analogue（c）

由圖3c可知，活性部位H72、D117、S212的柔性值比較小，幾乎是整條鏈上最小的區(qū)域，說明組成酶活性中心的3個氨基酸殘基的空間位置相對固定，因而活性中心的相對結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，在自然狀態(tài)下不會隨意發(fā)生變形，底物結(jié)合部位中S228、G230的柔性值比較小，說明這兩個殘基的空間相對位置比較固定，D207的柔性值比較大，這符合酶促反應(yīng)動力學(xué)誘導(dǎo)契合理論。在結(jié)合底物時，酶的結(jié)合部位和底物的結(jié)構(gòu)都發(fā)生了一定的形變（柔性才能形變），兩者在空間結(jié)構(gòu)上剛好互補，從而能很好地契合。全鏈柔性分析表明，黃粉蟲纖溶酶的活性中心和底物結(jié)合部位符合酶催化機理，從另一側(cè)面證明了活性中心預(yù)測的準(zhǔn)確性。

2．4 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用于精氨酸－賴氨酸肽鍵，使之?dāng)嗔训倪^程［11，12］。

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法，模擬黃粉蟲纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)，并對其全序列進行了分析。確定黃粉蟲纖溶酶的活性中心為 H72、D117、S212，底物結(jié)合部位為D207、S228、G230。黃粉蟲纖溶酶屬于水溶性球蛋白，其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測其催化纖維蛋白水解的機理是作用于精氨酸－賴氨酸肽鏈，使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

［1］Yu L，Han Y L，Tan Z J．Purification of a fibrinolytic protein from the yellow mealworm beetles，Tenebrio molitor［J］．Advanced Materials Research，2011，396（11）：103－105．

［2］陳雅雄，譚竹均，韓雅莉，等．黃粉蟲蛋白提取物纖溶活性及性質(zhì)研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2011，22（1）：169－171．

［3］葉韻，韓雅莉，黃明星．黃粉蟲胰蛋白酶樣酶基因TMTLSP全長cDNA的克隆和序列分析［J］．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2012，28（2）：169－176．

［4］Jaroszewski L，Rychlewski L，Li Z．A server for profile sequence alignments［J］．Nucleic Acids Research，2005，33（1）：284－288．

［5］Zhou H，Zhou Y．Fold recognition by combining sequence profiles derived from evolution and from depth－dependent structural alignment of fragments［J］．Proteins，2005，58（2）：321－328．

［6］Venclovas C，Margelevicius M．Comparative modeling in CASP6 using consensus approach to template selection，sequence－structure alignment and structure assessment［J］．Proteins，2005，61（7）：99－105．

［7］Rajesh S R，Chang J Y．Structural stability of human alpha－thrombin studied by disulfide reduction and scrambling［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2003，1651（1－2）：85－92．

［8］Cear E D，Dang Q D，Ayala Y M．Molecular mechanisms of thrombin function［J］．Cell Mol Life Sci，1997，53（9）：701－730．

［9］Bode W．Structure and interaction modes of thrombin［J］．Blood Cells，Molecules，and Diseases，2006，36（2）：122－130．

［10］Blow D M，Birktoft J J，Hartley B S．Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin［J］．Nature，1969，221（5178）：337－340．

［11］Stubbs M T，Bode W．A player of many parts：The spotlight falls on thrombin′s structure［J］．Thromb Res，1993，69（1）：1－58．

［12］Swain C G，Brown J F．Concerted displacement reactions．Ⅶ．The mechanism of acid－base catalysis in non－aqueous solvents［J］．J Am Chem Sci，1952，74（10）：2534－2538．