王志國(guó)，高連如

心血管疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因，全球每年約有1 700萬人死于心血管疾病，其中因急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)和慢性心功能不全而導(dǎo)致的死亡占心血管疾病病死率的50%以上。循證醫(yī)學(xué)研究表明，AMI即使早期成功血管重建也只能挽救缺血頓抑心肌。壞死心肌被纖維結(jié)締組織替代，向心室重構(gòu)進(jìn)展，有超過30%的患者發(fā)展為慢性缺血性心力衰竭。隨著人口的老齡化，心血管疾病患病率不斷增加，缺血性心力衰竭的患病率及病死率也在逐年升高[1]。如何解決心肌細(xì)胞丟失是心血管疾病治療中的關(guān)鍵問題。

20世紀(jì)末，美國(guó)科學(xué)家首次分離出人胚胎干細(xì)胞，并在體外成功建立了人胚胎干細(xì)胞系。與此同時(shí)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自多種組織的成體干細(xì)胞可分化為其他胚層組織，即成體干細(xì)胞的可塑性。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)展現(xiàn)了生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的廣闊前景，細(xì)胞移植替代壞死心肌細(xì)胞的理念應(yīng)運(yùn)而生[2-3]。2001 年 Orlic[4]將骨髓干細(xì)胞移植到小鼠梗死心肌后9 d可見移植細(xì)胞在梗死心肌存活，并分化為具有心肌表型特征的心肌樣細(xì)胞，明顯改善了心臟功能。從此，干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病迅速成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。

1 主要用于治療缺血性心臟病的干細(xì)胞

1.1 骨骼肌源性干細(xì)胞 骨骼肌和心肌細(xì)胞同屬橫紋肌，骨骼肌源性干細(xì)胞來源廣，取材容易是其優(yōu)點(diǎn)。已經(jīng)有臨床研究表明，骨骼肌源性干細(xì)胞移植能夠改善心功能。2003年巴黎比夏醫(yī)院的Menasche等[5]對(duì)10例心肌梗死伴嚴(yán)重心力衰竭患者在行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)同時(shí)進(jìn)行骨骼肌干細(xì)胞移植，隨訪10個(gè)月雖心功能改善，但4例發(fā)生室性心動(dòng)過速，都需安置除顫起搏器。2004年Siminiak等[6]對(duì)心肌梗死伴心力衰竭患者同樣進(jìn)行了骨骼肌干細(xì)胞移植術(shù)，術(shù)后依然有4例發(fā)生室性心動(dòng)過速。上述研究結(jié)果表明，骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間電偶聯(lián)可能存在問題。Hagège等[7]對(duì)全球2001年首批進(jìn)行自身骨骼肌干細(xì)胞移植的患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)52個(gè)月的隨訪，發(fā)現(xiàn)這些患者心功能分級(jí)指數(shù)有明顯改善，但也發(fā)現(xiàn)部分患者發(fā)生了室性心動(dòng)過速而不得不植入自動(dòng)體外除顫器(automated external defibrillator，AED)治療。也有臨床薈萃資料顯示，未發(fā)現(xiàn)致嚴(yán)重心律失常[8]。因此，骨骼肌干細(xì)胞移植的研究結(jié)果矛盾，安全性一直處于爭(zhēng)議之中，目前應(yīng)用較少。

1.2 胚胎心肌細(xì)胞/胚胎源性干細(xì)胞 胚胎心肌細(xì)胞/胚胎源性干細(xì)胞目前僅有基礎(chǔ)研究，而無臨床研究報(bào)道。胎兒心肌細(xì)胞體內(nèi)移植分化的研究表明[8]，急性心肌梗死大鼠模型制作成功后第5天將分離的胎兒心肌細(xì)胞分4點(diǎn)注射到心肌梗死區(qū)域。結(jié)果顯示，移植組大鼠梗死瘢痕組織中可見新生細(xì)胞生長(zhǎng)，可觀察到移植的細(xì)胞間有閏盤連接。應(yīng)用平滑肌a-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫組化染色證明，移植的胎兒心肌細(xì)胞已在壞死心肌區(qū)域存活、生長(zhǎng)增殖。超聲心動(dòng)圖可見細(xì)胞移植組大鼠左室收縮功能明顯改善，并限制了心室進(jìn)一步擴(kuò)大的重構(gòu)過程。胎兒心肌細(xì)胞雖具有最好的再生心肌能力，但其臨床應(yīng)用還存在許多問題，如倫理道德、法律以及免疫排斥、致腫瘤性等均有待解決[9]。

1.3 心肌源干細(xì)胞 心肌源干細(xì)胞目前已經(jīng)有臨床應(yīng)用報(bào)道。長(zhǎng)期以來，人們一直認(rèn)為心肌組織是一種終末化組織。2001年美國(guó)紐約醫(yī)學(xué)院Beltrami等[10]基礎(chǔ)研究表明，心肌內(nèi)存在心肌干細(xì)胞。此后，Beltrami等[11]應(yīng)用膠原酶消化成熟心肌細(xì)胞，以Lin－c-kit+和Sca-1+作為心肌干細(xì)胞表達(dá)的分子標(biāo)志，應(yīng)用免疫磁珠分離到心肌干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化，7～10 d后29%～40%細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞，20%～26%細(xì)胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞，18%～23%轉(zhuǎn)化為平滑肌細(xì)胞。將c-Kit+細(xì)胞注入冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠梗死心肌，20 d后，梗死面積明顯縮小，并可見冠狀小動(dòng)脈及毛細(xì)血管再生。也有基礎(chǔ)研究報(bào)道Sca-1+心肌源干細(xì)胞移植未見到明顯效果[12]。在2011年Lancet發(fā)表心肌源干細(xì)胞臨床應(yīng)用Ⅰ期臨床注冊(cè)研究報(bào)告，Bolli等[13]將自體心肌干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植治療缺血性心肌病，入選患者全部有心肌梗死史，左心射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)＜40%，給予冠狀動(dòng)脈灌注心肌干細(xì)胞后4個(gè)月14例LVEF提高8%，1年LVEF提高12.3%，磁共振檢查表明梗死范圍減少24%，無任何不良反應(yīng)。目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)。自體心肌源干細(xì)胞關(guān)鍵問題在于需要外科手術(shù)且取材難，能提取的干細(xì)胞數(shù)量少，需要進(jìn)一步增殖。

1.4 骨髓源性干細(xì)胞 骨髓源性干細(xì)胞是目前臨床應(yīng)用最多的干細(xì)胞，來源于骨髓的各種干細(xì)胞群，包括造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、側(cè)群細(xì)胞等。盡管其細(xì)胞成分復(fù)雜，干細(xì)胞含量低，但是多數(shù)研究者一致認(rèn)為骨髓源作為供體細(xì)胞是包含多種原始細(xì)胞的混合細(xì)胞群體。其不僅提供了多種組分混合的具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，也提供了多細(xì)胞間相互依賴生存的分化誘導(dǎo)微環(huán)境，將最大限度地發(fā)揮骨髓干細(xì)胞的分化潛能，更好地保留了原始干細(xì)胞的歸巢功能，更好的發(fā)揮了其旁/自分泌功能;且易于獲取，細(xì)胞數(shù)目較多，避免了在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的污染機(jī)會(huì)等諸多優(yōu)點(diǎn);最重要的是可以從自體獲得，為自體干細(xì)胞，不存在倫理道德及免疫排斥問題。到目前為止，國(guó)外已發(fā)表20余個(gè)臨床研究，在New England Journal of Medicine報(bào)道了幾個(gè)較大的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞治療AMI的多中心、隨機(jī)對(duì)照甚至少數(shù)雙盲臨床研究[14-16]。Lipinski等[17]薈萃分析698 例 AMI，包括10個(gè)臨床研究，其中7個(gè)是隨機(jī)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous transluminalcoronaryintervention，PCI)或PCI+骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植，LVEF平均增加3(1.9～4.1)%，左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)平均減少7.4(2.7～12.2)ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;梗死面積平均縮小5.6(2.5～8.7)%。國(guó)內(nèi)海軍總醫(yī)院心內(nèi)科在2002—2010年進(jìn)行了一系列自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植治療缺血性心臟病的研究[18-21]，急性心肌梗死患者移植后3個(gè)月隨訪PET檢查顯示梗死區(qū)域內(nèi)有代謝活力心肌增加，LVEF增加6.83%，而對(duì)照組單純PCI手術(shù)者無改善;2年隨訪表明，骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植組左室射血分?jǐn)?shù)1年保持增加5.79%(P＜0.05)，2年增加3.79%(P＞0.05)，但LVEDV、LVESV無顯著改善。有報(bào)道應(yīng)用異體骨髓干細(xì)胞經(jīng)靜脈輸注或安慰劑的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，異體骨髓干細(xì)胞輸注安全，無不良反應(yīng)，左室收縮功能及左室重構(gòu)均優(yōu)于安慰劑組[22]。異體骨髓干細(xì)胞移植主要存在來源困難、醫(yī)學(xué)倫理和免疫排斥等問題。

1.5 胚胎外組織來源的干細(xì)胞 如臍血MSCs、臍帶MSCs、胎盤MSCs等，其病毒污染概率低、免疫源性弱，無社會(huì)、倫理和法律方面的爭(zhēng)議。但臍血MSCs分離效率很低，臍帶、胎盤細(xì)胞混雜，限制了在細(xì)胞治療中的廣泛應(yīng)用。目前，比較有前景的是臍帶華通膠(Wharton's jelly，WJ)源間充質(zhì)干細(xì)胞。華通膠來源于胚胎發(fā)育13 d左右的胚外中胚層，包圍在遷移中的胚胎血島周圍，是一種黏稠的富含黏多糖和蛋白聚糖的膠狀物質(zhì)，內(nèi)含具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，被稱為“肌纖維母細(xì)胞”。這些細(xì)胞在體外具備定向分化能力[23-24]，符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)對(duì)MSCs的規(guī)定，因此稱之為WJ-MSCs。WJ-MSCs增殖能力明顯強(qiáng)于骨髓MSCs，在體外培養(yǎng)倍增時(shí)間短，7次傳代后細(xì)胞數(shù)目可達(dá)300倍，傳15～20代細(xì)胞亦無明顯衰老?；A(chǔ)研究表明，人WJ-MSCs移植給心肌梗死大鼠可改善左心室功能[25]，目前已經(jīng)有臨床研究的安全性報(bào)道[26]。WJ-MSCs來源廣泛，取材方便，無倫理爭(zhēng)議，即使在剖腹產(chǎn)后48 h的臍帶中仍可獲得，具有較低的病毒污染率;而且凍存和復(fù)蘇后存活細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝無變化，可建庫使用，是組織損傷細(xì)胞學(xué)治療的理想選擇。

1.6 經(jīng)基因工程修飾的干細(xì)胞 部分臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，干細(xì)胞移植后心功能沒有持續(xù)改善，考慮可能與干細(xì)胞的數(shù)量、生存情況和分化方向的不確定有關(guān)。選擇合適的目的基因，通過載體組合轉(zhuǎn)入干細(xì)胞中，有可能改善上述狀況，從而提高移植的效果。目前基礎(chǔ)研究有希望的基因:提高干細(xì)胞存活能力的抑制細(xì)胞凋亡的S100A1基因、AKT基因、bcl-2基因、Pim-1激酶基因等[27-30];促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的CC趨化因子受體1(CC chemokine receptor type 1，CCR1)基因[31];也有報(bào)道編程 connexin-43、connexin-45[32-33]基因可改善分化后的干細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞的電偶聯(lián)，減少移植后心律失常的發(fā)生。基因修飾干細(xì)胞應(yīng)用于臨床主要是安全性問題，基因插入可能引起某基因失活、重組，甚至激活癌基因;而且目的基因的表達(dá)程度也難以控制，表達(dá)過高是否存在不良反應(yīng)仍不清楚，目前尚未應(yīng)用于臨床。

2 干細(xì)胞移植在心血管疾病治療中的主要方法

2.1 經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射 經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射是應(yīng)用最為廣泛的移植方法[18-20]。其優(yōu)點(diǎn)為細(xì)胞可以直接在介入治療過程中給予，無需特別的器械，經(jīng)靶血管移植至目的心肌區(qū)域;經(jīng)動(dòng)脈移植也能保證移植的細(xì)胞有血液供應(yīng)。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果選用合理移植路徑，以移植細(xì)胞最大程度達(dá)到靶區(qū)域?yàn)槟康?，如選用超選擇性、左右主干灌注、側(cè)支血管逆行灌注、橋血管灌注等，使注入細(xì)胞彌散均勻，保證血流灌注，有利于移植細(xì)胞分化生長(zhǎng)。其缺點(diǎn)為細(xì)胞需要經(jīng)過血管壁遷移至血管外，效率低于直接心肌內(nèi)注射移植。

2.2 經(jīng)心外膜和經(jīng)心內(nèi)膜心肌注射 直接心肌注射效率要優(yōu)于經(jīng)冠狀動(dòng)脈途徑注射，但注射部位如為缺血心肌組織甚至為瘢痕組織，移植的細(xì)胞常不能夠獲得足夠的血液供應(yīng);另外，局部注射移植很可能形成異常細(xì)胞島，致心律失常不容忽視[5]。經(jīng)心外膜注射骨髓單個(gè)核細(xì)胞通常是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)的一個(gè)補(bǔ)充治療。經(jīng)心內(nèi)膜注射則需要特殊的器械(心內(nèi)膜電機(jī)械標(biāo)測(cè)系統(tǒng))[34]，較為復(fù)雜。

2.3 經(jīng)外周靜脈注射 經(jīng)外周靜脈內(nèi)注射法效率低于其他移植方法，有效性存在爭(zhēng)議。有研究表明，在梗死心肌內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)移植歸巢的干細(xì)胞[35-36]。

2.4 經(jīng)冠狀靜脈注射 經(jīng)冠狀靜脈注射需要采用復(fù)雜的導(dǎo)管系統(tǒng)伴行技術(shù)(經(jīng)靜脈心肌內(nèi)注射)，盡管用球囊封堵，血流開放后血流方向會(huì)導(dǎo)致移植細(xì)胞流向心房，導(dǎo)致移植效率降低[37]。

3 干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的機(jī)制

干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的機(jī)制除了移植的干細(xì)胞分化為心肌組織細(xì)胞和新生血管外，移植細(xì)胞發(fā)揮的旁分泌作用目前越來越被重視。大量研究表明，移植的干細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量生物活性因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor receptor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(hepatocyte growth-promoting factors，HGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGF)、腎上腺髓質(zhì)素、胸腺素β4、基質(zhì)細(xì)胞源性因子-1α(stromal cellderived factor-1alpha，SDF-1α)、血小板源性生長(zhǎng)因子、心房利鈉肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)等，這些旁分泌因子的作用包括抗炎抗凋亡、減輕纖維化、促進(jìn)新生血管生成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、減輕心臟負(fù)荷的作用，從而最終修復(fù)受損組織并改善心臟功能[38-41]。

4 干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病存在的問題

基礎(chǔ)和臨床研究均已表明，干細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景。干細(xì)胞技術(shù)在帶給人們無限希望的同時(shí)也帶來了一系列的問題，其中首要的就是倫理問題。胚胎干細(xì)胞的利用將破壞生命的原始形態(tài)的胚胎，這方面?zhèn)惱韱栴}是公認(rèn)的;更重要的是目前基礎(chǔ)研究進(jìn)展快速，使得“一切均有可能”，“生物技術(shù)將打開通往后人類(post-human)的大門”[42]，這是即將要面對(duì)的更深層的倫理問題。國(guó)家需要作出具有法律效力的規(guī)定，并根據(jù)技術(shù)的進(jìn)展不斷進(jìn)行調(diào)整。而干細(xì)胞技術(shù)在臨床應(yīng)用仍面臨遠(yuǎn)期安全、質(zhì)量控制、移植細(xì)胞在不同心肌微環(huán)境下的分化方向及如何控制等一系列問題，需要進(jìn)行廣泛的臨床試驗(yàn)。這些試驗(yàn)潛伏著諸多不確定因素，因而有著很高的風(fēng)險(xiǎn)。

總之，目前干細(xì)胞移植治療心血管疾病的基礎(chǔ)研究已經(jīng)積累了大量的數(shù)據(jù)及結(jié)果，臨床研究也取得了初步的成效，但是尚未能轉(zhuǎn)化為臨床的廣泛應(yīng)用。目前，關(guān)鍵問題是基礎(chǔ)研究仍在進(jìn)一步深入，但臨床應(yīng)用則一直沒有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于基礎(chǔ)研究。所以，下一步研究的重點(diǎn)是總結(jié)并完善目前已有的基礎(chǔ)研究成果，選擇最安全有效的技術(shù)真正轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

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