李 娜，周偉芳，劉慧敏，李 贊，仇華吉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱150001；3.上海奉賢動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，上海201400)

疫苗佐劑是能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答、發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。佐劑能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體保護(hù)能力，同時(shí)又能減少免疫物質(zhì)的用量，降低疫苗的生產(chǎn)成本。長期以來，傳統(tǒng)疫苗(多為菌體或其裂解物)由于其免疫原性強(qiáng)，佐劑的研究和使用只局限于較小的范圍，如毒素和類毒素。從巴斯德至今近百年來已開發(fā)了許多菌苗和疫苗，但傳統(tǒng)的菌疫苗一般多為全細(xì)菌或全病毒制成，其中含有大量非免疫原性物質(zhì)，這些物質(zhì)除具有毒副作用外也具有佐劑作用。所以一般不需要外加佐劑，因此在這段時(shí)間里免疫佐劑并未引起人們廣泛的注意。直到1925年，法國免疫學(xué)家兼獸醫(yī)學(xué)家Gaston Ramon發(fā)現(xiàn)在疫苗中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)白喉和破傷風(fēng)毒素的抵抗反應(yīng)[1]，從此許多國家都不同程度的開展了這方面的研究。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，針對(duì)不同疾病已開展了各種新型基因工程疫苗的研制，但這些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、難以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答等不足，從而需要某種物質(zhì)來增強(qiáng)其免疫作用，免疫佐劑尤其是新型免疫佐劑的研究就顯得尤為迫切。近年來，為適應(yīng)新型疫苗的需求，佐劑已經(jīng)從傳統(tǒng)、單一的形式向新型、多元化形式發(fā)展，尤其用于黏膜疫苗、DNA疫苗及腫瘤疫苗的佐劑研究成為熱點(diǎn)。本文對(duì)傳統(tǒng)及新型佐劑種類做了較為詳細(xì)的闡述，并針對(duì)這些佐劑提出了存在的問題，同時(shí)對(duì)佐劑的發(fā)展趨勢(shì)做了展望。

1 疫苗佐劑的概念

佐劑(Adjuvant)又稱免疫調(diào)節(jié)劑(Immunomodulator)或免疫增強(qiáng)劑(Immune potentiator)，是指先于抗原或與抗原同時(shí)應(yīng)用，能夠非特異地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，以及增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型，而本身無抗原性的物質(zhì)?！白魟币辉~來源于拉丁文“Adjuvare”，意味著輔助或者增強(qiáng)。疫苗佐劑可以用于不同的目的：(1)增強(qiáng)純化的或者重組抗原的免疫原性、免疫應(yīng)答速度及耐受性；(2)降低抗原的用量或者達(dá)到免疫保護(hù)所需要的接種劑量；(3)提高疫苗在嬰兒、老年人或者免疫系統(tǒng)受損人群的免疫效力；(4)作為通過黏膜攝取抗原的抗原遞送體系，可促進(jìn)胃腸黏膜對(duì)疫苗的吸收。佐劑的概念來源于在接種部位形成的潰瘍，并促進(jìn)高水平特異性抗體的產(chǎn)生，即使是由接種不相關(guān)的物質(zhì)產(chǎn)生的潰瘍也能夠誘導(dǎo)高特異性抗體的產(chǎn)生；(5)佐劑能夠增加對(duì)細(xì)胞的滲入性，防止抗原降解，將抗原運(yùn)輸?shù)教禺惖目乖岢始?xì)胞，增強(qiáng)抗原的呈遞或誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放。

2 傳統(tǒng)佐劑

2.1 鋁佐劑 自1926年首先發(fā)現(xiàn)鋁佐劑沉淀的白喉類毒素懸液要比類毒素本身具有更高的抗原性以來，鋁佐劑已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物疫苗制備。鋁佐劑苗可以分為鋁沉淀疫苗和鋁吸附疫苗兩種，鋁沉淀疫苗是將鋁劑懸液加至抗原液中，鋁吸附疫苗是將抗原溶液加至氫氧化鋁或磷酸鋁中。兩種鋁佐劑疫苗不僅能夠減少抗原用量，還能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。鋁佐劑通常用氫氧化鋁，其次是明礬及磷酸三鈣。

長期以來關(guān)于鋁佐劑疫苗的具體機(jī)制尚不明確。近年來，人們對(duì)于氫氧化鋁的作用機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。2007年Li等研究表明巨噬細(xì)胞主要對(duì)抗原進(jìn)行吞噬和破壞作用，鋁則激活細(xì)胞內(nèi)源性免疫應(yīng)答相關(guān)的Nalp3炎性復(fù)合體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生高水平的促炎癥因子IL-1β和IL-18[2]。Eisenbarth等進(jìn)一步研究表明氫氧化鋁佐劑還可激活Th2細(xì)胞分泌IL-4，誘導(dǎo)MHC-II類分子和CD83、CD86等的表達(dá)，誘導(dǎo)Th2型體液免疫應(yīng)答[3]。

鋁佐劑優(yōu)勢(shì)在于：不僅具有良好的吸附作用，能夠?qū)⒖扇苄钥乖接阡X佐劑分子表面；還是良好的沉淀劑，可以濃縮抗原，減少注射劑量。鋁佐劑成本低廉、使用方便、無毒，是獸醫(yī)生物制品中應(yīng)用最廣的一種佐劑，也是至今唯一被FDA批準(zhǔn)可用于人類疫苗的佐劑。

鋁佐劑也存在一些問題：鋁鹽在許多情況下并不是一個(gè)好的佐劑，尤其是在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答上。當(dāng)鋁佐劑通過皮下或皮膚內(nèi)注射而不是肌肉內(nèi)注射的路徑時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生肉芽腫。另外一個(gè)副作用就是增加了IgE的產(chǎn)生、變態(tài)反應(yīng)和可能的神經(jīng)毒性。

2.2 油乳佐劑 這種類型的佐劑一般包括水包油或者油包水乳劑和水包油包水雙相乳劑。油水乳劑中最著名的是弗氏佐劑(Freund's adjuvant，F(xiàn)A)，又可分為弗氏不完全佐劑(FIA)和弗氏完全佐劑(FCA)。FCA其中含有滅活的分枝桿菌(長介菌)成份，是標(biāo)準(zhǔn)的誘生體液和細(xì)胞免疫佐劑，可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)IgG的產(chǎn)生，抑制IgM的產(chǎn)生，從而抑制免疫耐受的產(chǎn)生，推遲超敏反應(yīng)，增加移植排斥，促進(jìn)抗腫瘤作用。FIA則是典型的只誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子、誘生抗體的佐劑。油佐劑的作用機(jī)制主要是在注射部位形成抗原儲(chǔ)藏庫，從而使抗原緩慢釋放刺激漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，但緩釋功能并非油佐劑的最大優(yōu)勢(shì)。

礦物油不能被代謝，因此會(huì)產(chǎn)生一系列的副作用：包括注射部位的炎癥反應(yīng)、肉芽腫、潰瘍和發(fā)熱等。另外，礦物油以及其中的組分如姥鮫烷、正十六烷等會(huì)引起佐劑型關(guān)節(jié)炎等自身免疫反應(yīng)。因此，礦物油乳佐劑毒性太大一般不能用于人類疾病預(yù)防的疫苗，盡管它們可以用于某些能夠承受這些毒副作用的癌癥患者。此外，乳化劑的毒性也必須注意。

隨著乳化技術(shù)的進(jìn)步，油佐劑中所應(yīng)用的油成分逐漸降低(不高于5%)，如Seppic系列佐劑；或者選擇可代謝油取代初期的礦物油來制備更為安全、穩(wěn)定、有效的免疫佐劑，如MF59、AS03、AF03和SE等。MF59是目前研究較熱門的佐劑之一。由角鯊烯、Tween-80和Span-85等組成，既可以刺激產(chǎn)生體液免疫也可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫，已廣泛用于各種亞單位疫苗佐劑，為繼鋁佐劑之后唯一被批準(zhǔn)的人用佐劑。它對(duì)各種動(dòng)物和各年齡段的人均可以產(chǎn)生高于鋁佐劑水平的抗體，用量少、毒性極低[4]。

3 新型佐劑

近年來，活載體疫苗、DNA疫苗等新型疫苗的研究取得了快速進(jìn)展，但這些疫苗免疫原性弱，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不夠強(qiáng)，需要配合佐劑以提高其免疫原性。然而常規(guī)佐劑存在著一定的局限性，于是新型佐劑的研究受到越來越多的關(guān)注。

3.1 微生物來源佐劑 微生物(布氏桿菌、沙門氏菌和結(jié)核桿菌等)和微生物產(chǎn)物有較強(qiáng)的佐劑活性。

3.1.1肽聚糖(PG)PG主要來自微生物的細(xì)胞壁，如胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、蠟質(zhì)D、海藻糖雙霉菌酸脂(TDM)等。其中對(duì)MDP、MTP研究的較多。MDP是從分枝桿菌細(xì)胞壁中提取的一種免疫活性成份。主要增強(qiáng)體液免疫，將它與脂質(zhì)體或與甘油混合使用可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。與TDM聯(lián)合使用可以有效地抑制腫瘤的生長，顯著增強(qiáng)注射動(dòng)物抗細(xì)菌和病毒感染能力。最近研究表明，MDP能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子，被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的佐劑之一。其優(yōu)點(diǎn)是注射局部反應(yīng)輕微、無抗原性、過敏性和致癌作用；相對(duì)分子量小，對(duì)生物學(xué)降解作用有抵抗力，可以口服。不良反應(yīng)是存在熱源性，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)賴特爾過敏綜合癥。

3.1.2革蘭氏陰性菌外膜脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)另一種來源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要復(fù)合物是LPS，LPS可激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均具有佐劑作用，并可以提高蛋白對(duì)多糖抗原的免疫應(yīng)答。然而他們也表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性作用，這種毒性作用是由巨噬細(xì)胞釋放的IL-1和TNF介導(dǎo)的。Geurtsen等將LPS或其類似物作為無細(xì)胞百日咳疫苗佐劑免疫小鼠，既可增強(qiáng)疫苗的效力，又可降低Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生[5]。

LPS中起佐劑效應(yīng)的主要成分是類脂A。在酸性條件下，類脂A可以被水解得到單磷脂A(MPL)，該復(fù)合物保持了類脂A的佐劑活性并降低了毒性作用。作為Th1型佐劑，MPL在人和動(dòng)物研究中顯示出了可以接受的安全性。目前，MPL已經(jīng)在大量的人類試驗(yàn)中作了評(píng)估，而且已經(jīng)被用于一些疫苗制劑比如作為乙型肝炎和HSV-Ⅱ疫苗制劑[5-6]。目前，MPL已經(jīng)用于HPV疫苗佐劑[7]。

3.1.3分枝桿菌及其組份分枝桿菌在獸醫(yī)中廣泛地應(yīng)用于疫苗，如牛分枝桿菌卡介苗是早期應(yīng)用成功的一種。分支桿菌經(jīng)化學(xué)和物理方法處理，可以獲得具有佐劑活性的成份，包括MDP、MTP、蠟質(zhì)D等。以結(jié)核桿菌為主的分枝桿菌菌體的活性因子存在于細(xì)胞骨架(CWS)中，含有CWS的FCA佐劑，能夠刺激產(chǎn)生的循環(huán)抗體量增加，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫形成，并能夠持續(xù)相當(dāng)長的時(shí)間。

3.1.4CpG寡核苷酸(CpG ODN)有證據(jù)表明分枝桿菌DNA具有佐劑活性，由此發(fā)現(xiàn)佐劑活性與細(xì)菌核酸中較高含量的CpG基序有關(guān)。CpG ODN是指一類以非甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤核苷酸為核心的寡聚脫氧核糖核苷酸。CpG ODN是最有效的細(xì)胞佐劑之一。

CpG ODN可以激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞；刺激淋巴細(xì)胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白；誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-1、IL-2、IL-12和 IFN-γ等多種細(xì)胞因子，因此CpG ODN在誘導(dǎo)機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型等方面發(fā)揮著重要作用。尤其是人工合成的CpG寡核苷酸，精煉了細(xì)菌DNA的有效成分，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的雙重作用，是一種具有潛力的新佐劑，特別是在抗過敏性疾病、腫瘤和傳染病等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

雖然CpG ODN具有安全有效等優(yōu)點(diǎn)，但還是有許多問題有待于解決：比如它的免疫激活機(jī)制、免疫劑量(高劑量CpG ODN及重復(fù)給藥可能導(dǎo)致毒性效應(yīng))和最適免疫途徑還需要進(jìn)一步研究。目前CPG作為人用乙肝疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

3.1.5霍亂毒素(Cholera toxin，CT)在毒素來源的佐劑中以霍亂毒素最為有效。它是一種有效的經(jīng)口服和不經(jīng)腸道的佐劑，由霍亂弧菌產(chǎn)生，是目前試驗(yàn)階段粘膜免疫效果最好的佐劑，它包括兩個(gè)主要的亞單位A和B。只有非毒性的五聚體亞單位B，即霍亂類毒素CTB被用做佐劑。CTB有運(yùn)輸抗原并促進(jìn)定位的作用，通常激發(fā)一個(gè)Th2或者混合的Th1/Th2但傾向Th2的免疫應(yīng)答[8]。在小鼠試驗(yàn)中，CT還能夠誘導(dǎo)Th17的免疫應(yīng)答，在經(jīng)治療的小鼠肺中還伴隨有中性粒細(xì)胞的累積和IL-16的增加[9]。同時(shí)，CTB還是一種良好的蛋白半抗原和弱免疫原的載體，共同免疫時(shí)可以賦予半抗原免疫原性，增強(qiáng)弱免疫原的免疫原性，CTB作為一種良好的免疫佐劑和蛋白抗原輸送載體，雖然目前距實(shí)際應(yīng)用仍有一定的距離，但應(yīng)用前景良好。

3.2 微?？乖f送體系

3.2.1脂質(zhì)體脂質(zhì)體是合成的球體由脂質(zhì)雙分子層組成能夠包裹抗原，既可以充當(dāng)疫苗遞送的工具又可以作為佐劑。脂質(zhì)體的佐劑效力依賴于脂質(zhì)雙分子層的數(shù)量、電荷、組成成份以及制備的方法。脂質(zhì)體包裹DNA疫苗可以起到緩釋和保護(hù)作用，而且脂質(zhì)體可以被細(xì)胞膜融合、降解，將DNA釋放于細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

研究表明，脂質(zhì)體能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以增加循環(huán)抗體滴度或抗體形成細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用、抗原提呈作用以及增強(qiáng)免疫記憶。研究還表明，脂質(zhì)體還可以作為載體與其它佐劑如脂質(zhì)A、胞壁酰二肽及其衍生物[10]、IL-1/IL-2等[11]或DNA疫苗聯(lián)合使用，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-6和 IL-12，誘導(dǎo) CD8+細(xì)胞毒性 T細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答，同時(shí)增強(qiáng)APC的遞呈能力，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。

作為疫苗佐劑脂質(zhì)體也存在一些不足：穩(wěn)定性較差，磷脂中的不飽和脂肪酸儲(chǔ)存時(shí)會(huì)逐漸氧化，小脂質(zhì)體傾向于相互融合成大脂質(zhì)體，在融合過程中可以導(dǎo)致包入的抗原釋放。脂質(zhì)體在制備過程中要求一定的技術(shù)性，其費(fèi)用也比其他免疫佐劑高，目前對(duì)脂質(zhì)體的應(yīng)用研究還主要集中在醫(yī)學(xué)研究方面，在獸醫(yī)疫苗研究中的應(yīng)用前景還具有一定的不確定因素。

3.2.2聚合微球體在微粒聚合體系中，多聚微球體已經(jīng)得到了廣泛的研究。這些都是納米大小的具有生物相容性并且可生物降解的微球體，它們能夠結(jié)合不同的抗原，優(yōu)點(diǎn)之一就是能夠通過改變它們組份的相應(yīng)濃度來操縱降解動(dòng)力學(xué)從而控制抗原釋放的時(shí)間，而且被這些粒子捕捉的抗原以一種遲發(fā)連續(xù)的或者脈沖的方式釋放。近來已經(jīng)表明帶電荷的表面吸附抗原的聚丙交脂-乙交脂(PLG)微?？梢员挥糜谶f送抗原到APC。陽離子和陰離子PLG已經(jīng)被用于吸附各種抗原包括質(zhì)粒DNA、重組蛋白以及免疫刺激寡核苷酸，它們與鋁佐劑相比較將導(dǎo)致顯著加強(qiáng)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，卻僅有很微小的毒副作用。表面吸附了微粒的制劑在疫苗制備方面提供了一個(gè)遞送抗原的可替代的新穎的途徑。

聚合微球疫苗在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問題，如微球疫苗的安全性、抗原包載量、抗原與不同大小微球的結(jié)合程度、抗原微囊化后的穩(wěn)定性及微球儲(chǔ)存期間穩(wěn)定性等。

3.2.3惰性納米微球表面吸附抗原的固體惰性納米微球可以用于刺激CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，最佳納米球的直徑為1μm，近來有報(bào)道使用0.04μm～0.05μm的固體惰性納米球?qū)τ谟行У目乖f送到APC、產(chǎn)生有效的聯(lián)合的體液和CD8+T細(xì)胞免疫是一個(gè)非常有前景的策略[12]。這種新型納米疫苗的非凡效力通過單次免疫兩周后就能夠保護(hù)動(dòng)物免受腫瘤的傷害而且還能夠清除大的腫瘤團(tuán)塊的一個(gè)腫瘤攻毒試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫搅俗C明[13]。這種納米球與多種抗原結(jié)合，可以誘導(dǎo)小鼠[14]和羊分泌IL-4及IFN-γ[15]，進(jìn)而產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3.2.4納米鋁佐劑2.1中已經(jīng)陳述了鋁佐劑的諸多不足，這就需要其它佐劑來替代，或者進(jìn)一步研究制備粒徑均一、吸附能力強(qiáng)、分散性好、可以減少佐劑用量的納米鋁佐劑。在國內(nèi)，何萍等通過自制納米鋁佐劑，研究其對(duì)乙型肝炎病毒和狂犬病毒體液免疫應(yīng)答的影響[16]。結(jié)果納米鋁佐劑在誘導(dǎo)HBsAg和狂犬病疫苗體液免疫應(yīng)答的早期優(yōu)于常規(guī)鋁佐劑，能夠快速地激活和提高小鼠和豚鼠的免疫應(yīng)答和應(yīng)答水平。湯承等的研究表明納米鋁佐劑能夠誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生有效免疫保護(hù)抗體的時(shí)間比常規(guī)油佐劑疫苗提前4d并且無副反應(yīng)[17]，這對(duì)禽流感等重大傳染病的緊急預(yù)防接種具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.2.5免疫刺激復(fù)合物(Immunostimulating complexes，ISCOM)ISCOMs是40nm的大微粒由皂苷(Quil A)、油脂、膽固醇和抗原組成，通過前3個(gè)組份之間的疏水作用而結(jié)合在一起。疏水的或親水的抗原均可以結(jié)合到其復(fù)合物上。它們是通用的靈活遞送體系，可以增加抗原呈遞到B細(xì)胞以及被APC攝取的效率[18]。ISCOM具有產(chǎn)生全面免疫應(yīng)答的能力，顯示出優(yōu)越的免疫學(xué)價(jià)值。由于ISCOM產(chǎn)生有效免疫所需的抗原很少，使其有可能成為多價(jià)亞單位疫苗的有效佐劑。與其它佐劑相比，ISCOM更安全，能夠形成長效生物活性反應(yīng)，刺激產(chǎn)生粘膜免疫，對(duì)預(yù)防通過黏膜的致病微生物具有特別重要的意義[19]。

ISCOM具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，既可激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，又可刺激體液免疫。臨床研究表明，ISCOM是目前誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞系(CTL)反應(yīng)最強(qiáng)的免疫刺激物。已經(jīng)有許多人采用ISCOM技術(shù)研制獸用亞單位疫苗和遺傳工程疫苗。

3.2.6細(xì)胞因子細(xì)胞因子是具有重要生物學(xué)活性的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，是有效的免疫佐劑，可以保護(hù)機(jī)體免受病毒、細(xì)菌和寄生蟲的侵襲，對(duì)腫瘤免疫和臨床應(yīng)用也有增效作用。研究表明，白細(xì)胞介素 12(IL-12)、IL-2、IFN-γ、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等，在增強(qiáng)細(xì)胞毒性CTL、自然殺傷細(xì)胞活性和募集抗原提呈等方面有著重要作用，是促進(jìn)CTL免疫應(yīng)答的最佳細(xì)胞因子環(huán)境。

目前研究最多的是IL-12，在體內(nèi)它主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，同時(shí)激活NK細(xì)胞的殺傷功能，刺激其分泌IFN-γ，增強(qiáng)裂解活性，具有重要的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。其最大特點(diǎn)是在極低濃度時(shí)即具有顯著活性，高于IL-2和IFN。

IFN的生物活性主要表現(xiàn)在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞分裂及抗腫瘤等方面。在免疫調(diào)節(jié)方面，IFN能夠增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。IFN的分子質(zhì)量小，可以自由出入細(xì)胞，作用無特異性。

在免疫反應(yīng)中，GM-CSF能夠促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的分化、成熟和表達(dá)MHCⅡ類抗原和B7共刺激因子。它通過激活和募集APC來增強(qiáng)初次免疫反應(yīng)。目前GM-CSF作為腫瘤疫苗免疫佐劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[20]。Peter等將其用作流感疫苗的免疫佐劑，取得了理想的免疫效果[21]。Overton等將其嘗試性用于HIV感染病人的乙肝預(yù)防疫苗，但未成功[22]，若進(jìn)一步對(duì)其限制免疫應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行探索，也許能夠發(fā)現(xiàn)其更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

細(xì)胞因子在DNA疫苗應(yīng)用中有特殊的潛力，細(xì)胞因子可以和抗原在同一載體里共表達(dá)。另一方面，直接運(yùn)用IL-12和其他細(xì)胞因子作為可溶性蛋白已經(jīng)證明和黏膜佐劑一樣有效。

3.3 多糖(Polysaccharides) 多糖又稱多聚糖，是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)。植物多糖來源于植物的根、莖、皮、種子和花，由相同或不同單糖以α-或β-糖苷鍵所組成，分子量數(shù)萬甚至數(shù)百萬。

菊粉(MPI)是來源于菊科植物根部的一種碳水化合物，當(dāng)形成一種微粒形式時(shí)，它就是一種有效的體液和細(xì)胞免疫佐劑。MPI微粒子是一種有效的交替補(bǔ)體路徑的活化劑，因此可以激活先天免疫系統(tǒng)。MPI在推進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面尤其有效，而沒有其它佐劑比如FCA、Montanide或者QS21通常所表現(xiàn)出的毒性。MPI可以與其它許多佐劑成分聯(lián)合使用產(chǎn)生出一系列帶有不同程度的Th1和Th2活性的專用佐劑。比如A lgammulin就是MPI與氫氧化鋁的復(fù)合物，也被開發(fā)為佐劑，A lgammulin展示了一種比MPI單獨(dú)使用更高比例的Th2向Th1轉(zhuǎn)化的活性。MPI可以有效地誘導(dǎo)出Th1和Th2免疫應(yīng)答，不會(huì)誘導(dǎo)出IgE，也不會(huì)伴隨有任何局部或全身的毒性。MPI在體內(nèi)可以被代謝成簡單的果糖和葡萄糖，所以MPI是基礎(chǔ)佐劑不會(huì)有安全方面的考慮。

3.4 皰疹病毒VP22蛋白 單純皰疹病毒I型(HSV-1)UL49基因編碼的VP22是近年來人類基因治療研究的一個(gè)重要“載體”蛋白，其獨(dú)特的“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)(Protein transduction)”特性為基因轉(zhuǎn)移開辟了新的途徑。目前，HSV-1VP22已應(yīng)用于抗腫瘤研究、增強(qiáng)DNA疫苗、“自主復(fù)制型”RNA疫苗以及“自殺性”DNA疫苗的免疫效果研究。其作用類似于分子佐劑作用。Cheng等研究表明人乳頭瘤病毒-16型(HPV-16)E7融合于HSV-1VP22后使E7特異性CD8+T細(xì)胞活性得到顯著增強(qiáng)，顯示VP22可以增強(qiáng)辛德畢斯病毒(SIN)RNA復(fù)制子體內(nèi)擴(kuò)散能力從而提高疫苗效力[23]。表達(dá)VP22-E7融合蛋白的SIN復(fù)制子顆?？鼓[瘤作用也顯著強(qiáng)于編碼VP22-E7的裸DNA或裸RNA復(fù)制子[24]。

據(jù)報(bào)道，PRV UL49基因的編碼蛋白VP22，也具有“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)”功能，能夠?qū)⑴c之融合表達(dá)的綠色熒光蛋白在無任何輔助條件介導(dǎo)下(如脂質(zhì)體、磷酸鈣、電轉(zhuǎn)化、病毒載體等)直接導(dǎo)入細(xì)胞。我們研究證明，PRV VP22確實(shí)能增強(qiáng)復(fù)制子載體DNA疫苗和病毒載體疫苗的免疫效果[25-26]。Sun等構(gòu)建了融合表達(dá)豬瘟病毒(CSFV)E2基因和PRV UL49基因的重組腺病毒rAdV-E2UL49[26]。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，其免疫原性優(yōu)于其它重組腺病毒(rAdV-optiE2或rAdV-E2)，可以保護(hù)家兔免于強(qiáng)毒攻擊。

上述研究表明，皰疹病毒的的VP22蛋白確實(shí)能夠作為佐劑增強(qiáng)DNA或者RNA復(fù)制子甚至腺病毒遞送的RNA復(fù)制子疫苗的免疫效力，這也成為佐劑研究發(fā)展的一個(gè)方向。

3.5 天然來源佐劑

3.5.1蜂膠(Propolis)蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂(樹膠)，混入其上腭腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。內(nèi)含幾十種生物活性物質(zhì)、多種維生素。氨基酸、脂肪酸、多糖及酶等，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)菌和抗霉菌作用。配合抗原注入機(jī)體，可以增強(qiáng)補(bǔ)體功能、增強(qiáng)免疫功能細(xì)胞及吞噬細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，從而增強(qiáng)免疫功能。

近幾年來對(duì)蜂膠的免疫功能的研究取得了許多滿意的效果。據(jù)報(bào)道，用淫羊藿總黃酮和蜂膠初提物研制的淫羊藿一蜂膠佐劑(Epimedium-Propolis adjuvant，EPA)與疫苗配合使用，可以顯著提高機(jī)體免疫功能[27]。趙恒章等以油乳劑、蜂膠和鋁膠為佐劑，按一定比例配制成巴氏桿菌的滅活苗。經(jīng)試驗(yàn)證明，油乳劑滅活苗的保護(hù)期和蜂膠滅活苗的保護(hù)期相當(dāng)，而蜂膠滅活苗的抗體水平上升速度比油乳劑苗快并且保護(hù)率高；鋁膠苗的效果不及蜂膠苗和油苗[28]。

3.5.2皂苷(Saponin)皂苷是從皂樹莖稈中分離并純化出來的一種表面活性劑，主要包括早期的Quil A和現(xiàn)在純度更高的QS-21。但Quil A存在嚴(yán)重的毒副作用，可以引起溶血、局部組織壞死和肉芽腫，不適用于人類。QS-21是通過反相色譜法從Quil A中純化的，具有比Quil A低的毒性和極強(qiáng)的免疫作用，能夠誘導(dǎo)CD4+Th1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。QS-21毒性雖然小了很多但也同樣不適用于大多數(shù)人使用，除非是能夠允許毒性較高的腫瘤疫苗或者以相對(duì)較低劑量使用。DEAE葡聚糖或許可以作為疫苗中皂苷佐劑的一個(gè)有效替代物。

4 現(xiàn)行佐劑存在的主要問題

4.1 安全性問題 以上所述的佐劑種類繁多，效果也是明顯的，但它們也有一些不可避免的缺點(diǎn)，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：佐劑的安全性和產(chǎn)生的局部副反應(yīng)。

佐劑的安全性是一個(gè)十分重要的問題，但又是一個(gè)容易被忽視的問題，研究表明，絕對(duì)安全的佐劑是不存在的。人們只能根據(jù)佐劑的作用機(jī)制進(jìn)行調(diào)整，盡可能做到免疫刺激作用最大化，而毒副作用最低化。臨床觀察設(shè)計(jì)時(shí)，要充分考慮佐劑、佐劑與疫苗使用引起的不良反應(yīng)的收集。如果是新佐劑與已上市抗原的臨床研究，應(yīng)有與已上市疫苗(佐劑和抗原)不良反應(yīng)的比較和分析。如果是新佐劑與新抗原，則應(yīng)按照國家有關(guān)要求，系統(tǒng)而詳細(xì)地收集不良反應(yīng)，包括局部和全身反應(yīng)、有關(guān)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)和儀器檢查結(jié)果等。

4.2 局部副反應(yīng) 一些佐劑可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫，但仍有個(gè)別試驗(yàn)者接種后出現(xiàn)較強(qiáng)的局部副反應(yīng)，反應(yīng)出現(xiàn)頻率具有抗原或劑量依賴性。疫苗佐劑的質(zhì)量控制是直接關(guān)系其臨床試驗(yàn)安全性的關(guān)鍵因素。如在1945～1960年疫苗研究中廣泛應(yīng)用的FIA，因其某批次出現(xiàn)質(zhì)量問題導(dǎo)致膿腫發(fā)生大量增加而最終于1960年后期被終止使用。盡管該佐劑具有較強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，但其不安全因素限制了進(jìn)一步發(fā)展，這種不安全因素主要與其使用劑量以及組份中礦物油化學(xué)鏈長度相關(guān)。

4.3 其它問題 除了上述兩個(gè)主要問題外，佐劑還存在一些問題：如油佐劑較粘稠不利于注射、乳化不好容易分層、同時(shí)在注射局部反應(yīng)較嚴(yán)重；氫氧化鋁佐劑難以誘導(dǎo)弱抗原的免疫反應(yīng)且不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；脂多糖佐劑存在較強(qiáng)的毒副作用、脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有待提高，氧化甘露聚糖與抗原結(jié)合方式局限、蜂膠佐劑注射部位形成腫塊等問題。某些佐劑作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不夠深入，使得新型佐劑的進(jìn)一步發(fā)展困難重重。另外一些佐劑由于制備過程復(fù)雜，價(jià)格昂貴也限制了它們的推廣應(yīng)用。

5 佐劑的未來發(fā)展方向

盡管免疫學(xué)知識(shí)在近十年有了很大的進(jìn)展，但令人吃驚的是在人類疫苗中還主要依賴鋁為基礎(chǔ)的復(fù)合物作為主要的佐劑。這種狀況在未來的幾十年對(duì)于已經(jīng)確定的高效疫苗中都不會(huì)改變。然而新的重組亞單位和合成抗原引入到HIV、丙型肝炎病毒、瘧疾和其它嚴(yán)重的疾病中以及對(duì)于慢性疾病和腫瘤的治療性疫苗的開發(fā)將會(huì)引入新的佐劑到臨床試驗(yàn)中。

新佐劑的劑型更應(yīng)該與開發(fā)針對(duì)引起病理?xiàng)l件的感染性病原的新疫苗相關(guān)，這些病理學(xué)條件主要以免疫缺陷、低免疫力者以及高危人群為特征。從這些高危人群開始，進(jìn)一步采取措施推廣新佐劑的應(yīng)用，可能在不久的將來人們負(fù)擔(dān)得起。

作用機(jī)制的研究將進(jìn)一步闡明佐劑活動(dòng)背后的分子的相互作用。這些連同生物信息學(xué)的開發(fā)將會(huì)提高新佐劑研發(fā)能力。

對(duì)佐劑的研究一直是疫苗研究過程中的重要環(huán)節(jié)，理想的佐劑應(yīng)該是廣譜、無副作用、對(duì)免疫系統(tǒng)具備有效的激活作用，同時(shí)便于生產(chǎn)和使用。目前，還沒有任何一種佐劑具備這些要求。隨著人們對(duì)各種病原體的抗原成分的不斷深入了解和抗感染免疫機(jī)理的認(rèn)識(shí)，對(duì)佐劑的研究也會(huì)更具有目標(biāo)性?？傊?，多來源、多途徑研發(fā)活性強(qiáng)、可生物降解、無毒副作用，甚至有治療作用的新型佐劑正成為當(dāng)前佐劑研究的熱點(diǎn)，佐劑正朝著多元化方向發(fā)展。新型佐劑的出現(xiàn)使我們?cè)谶M(jìn)行疫苗研究和制備時(shí)具有更多的選擇性。

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