劉翠華

隆回縣人民醫(yī)院藥劑科 422200

知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphode-loides Bunge)干燥的根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載百合性苦寒，具有滋陰降火、潤(rùn)腸滑燥、除煩止渴、利小便的作用。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，知母中主要含有甾體皂苷、雙苯吡酮類(lèi)，另有木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等，具有抗炎解熱、抗血小板聚集、降脂抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效，其主要活性成分為知母多酚［1］。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明［2］，知母多酚可顯著降低血糖水平，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善心血管并發(fā)癥。本文通過(guò)知母多酚對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈功能的影響，探討其對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)機(jī)制。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)材料:藥物與試劑:知母購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，藥材批號(hào):2011056，正丁醇(天津市達(dá)森制劑)，以芒果苷(上海同田生物有限公司生產(chǎn)，純度99.8%)為對(duì)照品;棕櫚酸，牛血清白蛋白(BSA)、胰島素注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):1105244)，重酒石酸去甲腎上腺素注射液(遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司);乙酰膽堿(Ach)、水楊酸鈉、D-葡萄糖、果糖、疊氮鈉均為分析純。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性SD大鼠，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證編號(hào):0002461;動(dòng)物采用分籠飼養(yǎng)，保持室溫21℃ ±3℃。

儀器:JH-2型肌張力傳感器、HW-400E恒溫平滑肌槽、BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，RF-5301PC型島津熒光分光光度計(jì)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:測(cè)量數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行分析，以表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

實(shí)驗(yàn)方法:(1)知母多酚的提取:取20g知母藥材適當(dāng)粉碎，分別以10倍量和6倍量水煎煮2次，過(guò)濾，合并濾液濃縮至1g/ml，加乙醇至含醇量70%，回收乙醇得流浸膏，加水至0.5g/ml，先調(diào)pH值至3，正丁醇萃取3次，取正丁醇層，再調(diào)pH值至7，用水萃取3次，得水層，最后調(diào)pH值至3，正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得知母多酚，收率為3.4%。⑵知母多酚與大鼠胸主動(dòng)脈舒張反應(yīng):選取體重在150～200g的雄性 SD大鼠，剪頭處理后迅速取出胸主動(dòng)脈，將其置于K-H液中并通入95%O2和5%CO2的混合氣體，分離血管周?chē)M織，祛除血管中的血液，剪成長(zhǎng)2～3mm血管環(huán)，固定于K-H液的浴皿中，通過(guò)張力換能器與生物機(jī)能記錄儀連接。給血管環(huán)施加2g左右的靜息張力，平衡1h后，加入高K+液，重復(fù)兩次，檢查標(biāo)本活性，然后用K-H液洗滌至基線。待動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，先用1×10－6mol/L的NE收縮血管環(huán)，再用ACh累進(jìn)劑量來(lái)舒張血管，待NE預(yù)收縮的血管舒張幅度＞80%時(shí)表示內(nèi)皮完整。分組處理已平衡的主動(dòng)脈環(huán):①正常組:繼續(xù)平衡1h;②棕櫚酸損傷組:浴皿中加入0.1mmol/L棕櫚酸溫浴 30min;③知母多酚組:分別加入 0.01、0.1、0.3mg/mL 的知母多酚，30min后加入棕櫚酸，觀察其對(duì)血管張力的影響。在上述各組中依次間隔加入胰島素10－6、10－5、10－4、10－3mmol/L，觀察胰島素誘導(dǎo)的舒張百分比。⑶知母多酚與體外糖基化修飾蛋白質(zhì):用PBS與BSA 0.5%、D-葡萄糖5mmol、果糖5mmol、疊氮鈉0.02%配制反應(yīng)液，將1.8mL反應(yīng)液分裝于2.0ml的 EP 管內(nèi)，再分別加入0.1ml1 ×10－2、8 ×10－3、6 ×10－3、4×10－3、2×10－3、1×10－3g/L 的知母多酚，將試管密封，在37℃下培育21d，形成糖基化修飾的白蛋白(AGE-BSA)，以鹽酸氨基胍為陽(yáng)性對(duì)照，另加空白糖基化系統(tǒng)、無(wú)蛋白的空白組、無(wú)糖空白組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。采用熒光光譜分析法，在激發(fā)波長(zhǎng)370/發(fā)射波長(zhǎng)450nm測(cè)定其吸收光譜，計(jì)算AGE-BSA含量。結(jié)果以熒光值表示，組間采用t檢驗(yàn)。

結(jié)果

知母多酚對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響:經(jīng)不同濃度知母多酚預(yù)處理后，可明顯改善受胰島素調(diào)節(jié)的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張，其中高劑量組與棕櫚酸損傷組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明知母多酚可保護(hù)血管內(nèi)皮，且作用程度與濃度呈梯度依賴(lài)性。

知母多酚對(duì)體外糖基化修飾蛋白質(zhì)的抑制:實(shí)驗(yàn)表明陽(yáng)性對(duì)照氨基胍鹽酸鹽的抑制率為76.22%;知母多酚(10－2g/L)的抑制率高達(dá)98.97%，說(shuō)明知母多酚能顯著抑制體外生成糖基化產(chǎn)物。

討論

知母多酚對(duì)血管內(nèi)皮的作用:內(nèi)皮細(xì)胞中L-精氨酸可在酶的作用下釋放的NO，NO經(jīng)擴(kuò)散與細(xì)胞膜上的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶結(jié)合后激活環(huán)化鳥(niǎo)苷酸(cGMP)，從而舒張血管平滑肌。適當(dāng)濃度的胰島素可促進(jìn)一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，促進(jìn)NO的釋放;此外，胰島素可經(jīng)蛋白激酶(MAPK)途徑刺激分泌內(nèi)皮素(ET)-1，并促進(jìn)E-選擇素的表達(dá)，從而隨機(jī)體適應(yīng)性的調(diào)節(jié)血管的舒縮反應(yīng)［3］。本實(shí)驗(yàn)棕櫚酸的作用是刺激大鼠主動(dòng)脈環(huán)，降低胰島素介導(dǎo)的主動(dòng)脈舒張作用。對(duì)于棕櫚酸損傷VEC依賴(lài)性血管舒張功能和減少內(nèi)源性NO釋放，知母多酚能夠顯著改善。

蛋白質(zhì)非糖基化:體內(nèi)還原糖與蛋白質(zhì)中氨基結(jié)合形成可逆的Shiff氏堿中間體，進(jìn)而形成穩(wěn)定可逆的蛋白復(fù)合物1-氨基-1-脫氧-D酮搪(Amadori)，Amadori產(chǎn)物及其降解的羰基化合物與游離氨基反應(yīng)生成具有熒光性的不可逆終產(chǎn)物AGEs，據(jù)研究表明，AGEs可滅活血管松弛因子，進(jìn)而阻礙了NO介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性血管舒張，導(dǎo)致血管痙攣［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明知母多酚可明顯抑制糖基化蛋白的生成。

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