陳麗萍 韓明麗 趙 根 李艷冬

（浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 313000）

多聚半乳糖醛酸（內(nèi)切）酶（Polygalacturonase，EC，3.2.1.15， 簡(jiǎn)稱 PG 或 endo-PG）是多聚-α-1，4-半乳糖醛酸聚糖水化酶 （poly-galacturonideglycanohydrase）的通用名，是可分解果膠或果膠酸酶類中的一種，亦稱果膠酶（pectic enzyme）或果膠解聚酶（pectin depolymerase）。PG是一種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，可以催化果膠分子多聚α-（1，4）-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化。而PG的多基因家族成員在植物發(fā)育不同階段和不同組織中的表達(dá)與果實(shí)成熟、細(xì)胞分離過程（如葉和花的脫落、豆莢開裂、花粉成熟、病原物防御、植物寄主互作）有關(guān)，還與細(xì)胞伸展、發(fā)育和木質(zhì)化有關(guān)。由于PG基因在果實(shí)成熟軟化中所起的作用不是很清楚，已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

1 多聚半乳糖醛酸酶的作用方式

早在1965年，Hobson用細(xì)胞壁蛋白粗提液體外降解純化果膠的方法發(fā)現(xiàn)了果實(shí)軟化與PG活性的相關(guān)性，并將PG按作用方式分為內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）和寡聚半乳糖醛酸酶（oligo-PG）。前者以內(nèi)切方式水解斷裂多聚半乳糖醛酸鏈，后二者以外切方式依次從半乳糖醛酸多聚鏈或寡聚鏈的非還原端釋放出一個(gè)單體或一個(gè)二聚體。Endo-PG對(duì)底物的特異性較強(qiáng)，exo-PG則較弱。Tieman等應(yīng)用免疫定位法檢測(cè)整個(gè)番茄果實(shí)中的PG蛋白，發(fā)現(xiàn)PG的積累首先出現(xiàn)于心皮到果實(shí)中柱的這部分組織中，其次出現(xiàn)于果皮組織和其輻射狀細(xì)胞的細(xì)胞壁中，在時(shí)間上PG的積累和茄紅素的積累同步，PG蛋白大多存在于細(xì)胞壁間層或初生壁，少量定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。另外，PG也在果實(shí)、葉和花脫落區(qū)，豆莢、花藥、花粉粒、花粉管及快速生長(zhǎng)組織中被檢出，表明PG參與植物發(fā)育的許多過程。

有人認(rèn)為番茄硬度下降與PG活性有密切關(guān)系，即PG含量越高，果實(shí)硬度越小，果實(shí)軟化程度越高。目前已從多種作物果實(shí)中克隆獲得了多聚半乳糖醛酸酶基因，陳儒鋼等從辣椒中分離克隆出果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶基因CaPG，序列分析表明，該基因全長(zhǎng) cDNA 為 1668bp，5’編碼區(qū)為 119bp，3’編碼區(qū)為442bp，CDS長(zhǎng)1107bp，編碼368個(gè)氨基酸，聚類分析表明該基因與番茄的親緣關(guān)系較近，該基因可能與番茄中的PG基因具有相似的作用。

2 多聚半乳糖醛酸酶的同工酶

PG已在許多植物果實(shí)中被分離純化，已經(jīng)從番茄、桃、蘋果、梨、香蕉、李、杏、葡萄、草莓、鱷梨、柿、橙、番木瓜等果實(shí)中分離出了大量與果實(shí)成熟軟化相關(guān)的PG基因（NCBI數(shù)據(jù)）。番茄、香蕉和草莓都有3種不同的同工酶，番茄和香蕉是一種同工酶在行使外-PG的功能，兩種行使內(nèi)-PG的功能，而草莓則相反。Tucker等在最早時(shí)研究番茄PG時(shí)發(fā)現(xiàn)共有2種同工酶，分別是PG1和PG2。PG1分子量較大，為115kd，等電點(diǎn)為8.6，熱穩(wěn)定性較好，出現(xiàn)于果實(shí)成熟的早期階段。Brady等后又發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)的成熟，出現(xiàn)2種分子量較小的同工酶，即PG2a和PG2b，分子量分別為43kd和46kd，其等電點(diǎn)均為9.4。以后的研究證實(shí)PG2a和PG2b是同一基因的產(chǎn)物，其差異只在于糖苷化的程度不同。這3種同工酶均為糖蛋白，PG蛋白的SDS變性及蛋白酶消化反應(yīng)、免疫交叉反應(yīng)表明了PG1是PG2a或PG2b與其它亞單位的非共價(jià)復(fù)合體。Giovannoni等證明了這3種同工酶在DNA水平上源自于同一PG基因組。PG1、PG2a和PG2b在果實(shí)成熟中出現(xiàn)的順序不一樣，PG1在成熟的早期占優(yōu)勢(shì)，而在完全成熟中則是PG2a和PG2b占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。β-亞基位由一單基因編碼，并且只能在果實(shí)組織中表達(dá)，其mRNA在果實(shí)成熟啟動(dòng)前幾天急劇增加并達(dá)到最大含量。β-亞單位定位于果皮的細(xì)胞壁，刺激對(duì)底物的作用能力。

3 多聚半乳糖醛酸酶基因

PG是由多基因家族編碼的，Kalaitzis等在番茄衰老的葉和花中獲得3個(gè)PG cDNA，分別為TAPG1、TAPG2和TAPG4。它們間的同源性為76%～93%，但是它們與果實(shí)中PG的同源性僅為38%～41%。在果實(shí)、莖、葉柄和花藥中未發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)，而且TAPG4比TAPG1和TAPG2轉(zhuǎn)錄的早。Kristena等報(bào)道，在瓜類果實(shí)中有PG介導(dǎo)的果膠物質(zhì)的分解，它們獲得了3個(gè) PGcDNA， 為 MPG1、MPG2和 MPG3。 MPG1和MPG2與桃和番茄衰老區(qū)PGs有關(guān)聯(lián)，MPG3與番茄果實(shí)PG有關(guān)聯(lián)。

目前已被克隆的果實(shí)PG基因大小約7kb，包含8個(gè)內(nèi)含子，其大小從99bp到953bp不等，調(diào)控基因表達(dá)的順式作用因子存在于PG基因的上游非編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄單位的5’末端的一個(gè)1.4kb片段直接參與了成熟特異基因的表達(dá)。所有被克隆的PG基因編碼的PG，N端都有一個(gè)疏水信號(hào)序列，引導(dǎo)PG蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔和定位于細(xì)胞壁。番茄PG蛋白經(jīng)歷了廣泛的共翻譯和后翻譯調(diào)節(jié)，包括疏水的N端信號(hào)序列的加工、前肽的加工、不同的糖基化和C端的加工而成。

在番茄中已確定了7個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因，即：TAPG1、TAPG2、TAPG3、TAPG4、TAPG5、TAPG6與TAPG7，并且在離區(qū)與果實(shí)中表達(dá)的基因并不相同。各基因家族成員分別調(diào)節(jié)不同的時(shí)空表達(dá)，不同的PG基因家族成員編碼的酶存在生物學(xué)性質(zhì)上的差異，如分解特異性和基質(zhì)特異性，其氨基酸順序也存在較大的差異性，如調(diào)控番茄成熟的PG氨基酸序列和甜瓜果實(shí)PG只有60%同源。但從植物克隆得到的序列來看，PG還是存在一些高度保守的區(qū)域，經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)來自不同物種的PG基因的氨基酸序列同源性較高，含有4個(gè)保守性極強(qiáng)的基序（motif）： ‘S294PNTDGIH301’， ‘G318DDC321’，‘C338GPGHG343’和‘R376IK378’。 大多數(shù)半胱氨酸（Cys，C）位點(diǎn)具有較強(qiáng)的保守性，然而3個(gè)進(jìn)化支中的PG蛋白還有各自的保守區(qū)域和各自保守的半胱氨酸。酶的催化功能可能歸功于這一區(qū)域高度保守的殘基。

4 多聚半乳糖醛酸酶基因表達(dá)的分子調(diào)控

目前通過分子水平調(diào)控PG基因的表達(dá)有兩種方法。一種是通過反義RNA技術(shù)對(duì)PG進(jìn)行負(fù)調(diào)控。Smith等將PG cDNA 5’端的730bp片段反向插入接上CaMV35啟動(dòng)子和Nos基因3’末端，構(gòu)建了一個(gè)反義融合基因，將其導(dǎo)入Binl9后再轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，用來轉(zhuǎn)化番茄莖段，在葉中和果中都發(fā)現(xiàn)了反義PG cDNA，其果實(shí)PG活性只有正常株的10%。Sheehy等用PG cDNA長(zhǎng)度為1600bp的包含有PG開放閱讀框架的片段也構(gòu)建了反義基因，得到的純臺(tái)體果實(shí)，成熟各階段的mRNA和PG的水平也大大降低。另一種方法是通過插入失活使PG基因不能表達(dá)。Cooley等用位點(diǎn)選擇性插入的方法（the siteselected insertion）在番茄PG基因中產(chǎn)生插入突變，這種插入突變能遺傳給后代，所用的插入誘變物為轉(zhuǎn)座子元件在得到的純臺(tái)系后代植株的果實(shí)中，PG的活性至少降低了99.9%（用粘度法表示酶活性）。這種插入突變較反義技術(shù)抑制基因的表達(dá)為優(yōu)，因?yàn)椴迦胪蛔兛梢允鼓繕?biāo)基因完全失活，多基因家族的多基因拷貝可以獨(dú)立突變，而且通過轉(zhuǎn)座子元件的切除所引起的序列改變能產(chǎn)生新的等位基因和表現(xiàn)型。Cooley等同時(shí)應(yīng)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生切除足印等位基因（excision footprint alle1），這種切除足跡（excision footprint allel）能在含有PG信息的框架內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子，從而使純臺(tái)型的果實(shí)中PG活性顯著降低。這樣在PG中就不含轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，應(yīng)用這種方法進(jìn)行植物基因工程改造具有極高的商業(yè)價(jià)值。

5 多聚半乳糖醛酸酶與植物激素的關(guān)系

果實(shí)采收后仍是一個(gè)活的有機(jī)體，有機(jī)體內(nèi)細(xì)胞之間及細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器之間相互聯(lián)系是其生命活動(dòng)必不可少的條件。這些聯(lián)系是通過各種信使系統(tǒng)來完成的，植物激素是細(xì)胞之間的第一信使，它在果實(shí)衰老進(jìn)程中起著重要的調(diào)控作用。

5.1 乙烯對(duì)多聚半乳糖醛酸酶的影響

乙烯是一種成熟衰老激素，它在果實(shí)的采后成熟、衰老進(jìn)程中起重要的調(diào)控作用。許多研究結(jié)果表明，PG基因的表達(dá)是受乙烯調(diào)控的，乙烯可以誘導(dǎo)綠熟番茄PGmRNA的積累。在不能正常成熟、乙烯合成受阻的突變體番茄Nr中，PGmRNA和PG酶的水平極低，乙烯合成抑制劑也可以抑制PGmRNA的積累；番茄中E4和E8基因是受乙烯調(diào)控的，其啟動(dòng)子中具有乙烯應(yīng)答元件，而PG基因的啟動(dòng)子也具有與這些乙烯應(yīng)答元件相似的序列。但在反義ACC和反義EFE轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)中，即使乙烯合成受到抑制，PGmRNA仍大量積累，但PG酶不會(huì)積累，表明mRNA的轉(zhuǎn)錄不受乙烯調(diào)控，乙烯只是控制PGmRNA的翻譯和多肽的穩(wěn)定性。Theologis等認(rèn)為，與成熟相關(guān)基因的表達(dá)受兩個(gè)獨(dú)立的途徑調(diào)控：一種不依賴乙烯，受階段調(diào)控；另一種依賴乙烯，PGmRNA的轉(zhuǎn)錄不需乙烯，而PG的翻譯是受乙烯調(diào)控的。

5.2 其它幾種植物激素

在果實(shí)成熟衰老過程中，ABA也起著重要的調(diào)控作用。周玉嬋等用5mg/L ABA處理芒果果實(shí)，貯藏期間果實(shí)的PG酶活性增高，軟化加快，ABA處理可能直接促進(jìn)了PG酶活性的增加。外源ABA處理能夠刺激越變前果實(shí)的乙烯生成，表明內(nèi)源或外源ABA也可能間接地發(fā)揮著乙烯的作用，促進(jìn)果實(shí)成熟軟化。

多胺對(duì)PG酶活性也有一定影響。蘋果經(jīng)多胺處理后，PG酶活性被顯著地抑制，硬度增加，然后緩慢下降，其下降進(jìn)程明顯減慢，其中以精胺處理的抑制效果最為明顯。芒果經(jīng)多胺處理也得到了同樣的結(jié)果。多胺和乙烯相互競(jìng)爭(zhēng)共同的前體物質(zhì)SAM，多胺延緩果實(shí)的后熟軟化很可能是通過抑制乙烯合成而間接抑制PG酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。生長(zhǎng)素、赤霉素和細(xì)胞分裂素對(duì)PG酶活性的調(diào)控作用研究很多。芒果經(jīng)5mg/L GA處理后，貯藏期間PG酶活性峰比對(duì)照推遲3d出現(xiàn)，且峰值較低，果實(shí)的成熟軟化受阻。

6 多聚半乳糖醛酸酶功能的多樣性

PG蛋白于35年前被首次分離并被認(rèn)為參與植物發(fā)育許多階段的果膠降解，尤其是那些需要細(xì)胞分化的階段。雖然PG參與植物發(fā)育的許多過程，但多數(shù)研究集中在果實(shí)成熟、離層區(qū)和花粉上。

6.1 與果膠的降解的關(guān)系

果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，主要存在于中膠層，初生壁中也有一部分，它與半纖維素一起組成共同伸展的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，纖維素微纖絲鑲嵌在其中，這是Carpita等提出的植物初生壁模型，果膠分子的主要特征是由α-（1、4）連接的D-半乳糖醛酸的羧基發(fā)生了甲基酯化，有的在線狀主鏈上插入一些鼠李糖單位，這些鼠李糖殘基上常常由富含阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的側(cè)鏈。果膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生系統(tǒng)性分解，因此果膠代謝在植物發(fā)育過程中具有重要的作用。

果實(shí)的軟化是細(xì)胞分離的結(jié)果。細(xì)胞分離是由胞間層結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)破壞以及胞壁物質(zhì)降解引起的。在果實(shí)的軟化期間果膠和半纖維素都發(fā)生了溶解和去聚化，被認(rèn)為與細(xì)胞壁的松懈及降解有關(guān)。PGs在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變中起重要作用，它可以催化果膠分子番茄果實(shí)中α-（1、4）-聚半乳糖醛酸的裂解，從而參與果膠的降解，促進(jìn)果實(shí)軟化，有以下幾個(gè)方面的證據(jù)。果實(shí)的軟化進(jìn)程與PGs活性增高一致。許多果實(shí)在成熟軟化過程中PGs活性都很高，這表明了果實(shí)的軟化和果膠的降解呈很好的相關(guān)性；在體外實(shí)驗(yàn)中，PGs能直接水解未成熟果實(shí)中分離得到的細(xì)胞壁材料；未成熟果實(shí)的果皮組織用PG酶液處理時(shí)，其超微結(jié)構(gòu)的變化與成熟時(shí)一樣；果實(shí)不能正常成熟和軟化的突變體（rin，nor）都缺乏PG。雖然PG在果實(shí)的軟化中起重要作用，但許多實(shí)驗(yàn)表明，PGs對(duì)于果實(shí)成熟軟化并不是必要的。

6.2 與器官脫落的關(guān)系

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，器官都會(huì)經(jīng)歷程序性衰老，也會(huì)從親本上脫落下來。脫落受發(fā)育程序控制器官分離斷裂，是細(xì)胞壁和中膠層在離層處破裂的結(jié)果。在產(chǎn)生離層過程中，果膠被溶解，中間層膨大、開孔并消失，微纖絲網(wǎng)絡(luò)與器官分開。細(xì)胞壁降解酶系統(tǒng)是導(dǎo)致植物離區(qū)細(xì)胞發(fā)生分離的主要原因，其中的PG是植物離區(qū)重要水解酶之一，其活性的升高與離區(qū)脫落進(jìn)程中強(qiáng)度的降低相一致，并且位于細(xì)胞發(fā)生分離的部位。

目前，在番茄中已明確了TAPG1、TAPG2、TAPG4和TAPG5在乙烯誘導(dǎo)的葉片和花柄脫落區(qū)中表達(dá)，但這些基因的表達(dá)非常復(fù)雜，現(xiàn)仍未明確在番茄花柄脫落中起決定作用的基因。豆莢的裂開和花藥的開裂都與脫落相似，雖然在裂開區(qū)未能肯定有PG活性，但已鑒定到到編碼假定裂開區(qū)?；磉_(dá)PG的cDNA，說明PG對(duì)豆莢的裂開起作用。

6.3 與植物授粉的關(guān)系

在許多物種（包括玉米、草本植物和大量的木本樹）的花粉中具有高水平的外切PG活性?；ǚ酃躊G通過作用于花粉管壁而加速生長(zhǎng)，可能exo-PG通過修飾不具活性的低聚半乳糖苷信號(hào)分子成為具活性的低聚體而引導(dǎo)花粉管通向子房。許多基因在花粉中表達(dá)，目前已從多種植物分離到花粉專一的基因。除看家基因外，根據(jù)其在有絲分裂前或后表達(dá)分成兩類：早期基因編碼的蛋白主要是細(xì)胞骨架蛋白以及與細(xì)胞壁合成、淀粉積累有關(guān)的蛋白；而后期基因可能編碼花粉成熟和花粉管生長(zhǎng)的蛋白。玉米、煙草、甘藍(lán)型油菜和其它物種上與PG有同源序列的cDNA已被鑒定，并被歸為后期基因。

6.4 與病害發(fā)生的關(guān)系

多聚半乳糖醛酸酶是降解植物細(xì)胞壁果膠的主要酶之一，在植物病原真菌的致病性中起著重要的作用。在許多真菌中已經(jīng)證實(shí)多聚半乳糖醛酸酶的缺失或失活會(huì)導(dǎo)致致病力下降，但是在有些真菌中多聚半乳糖醛酸酶基因的失活并不直接影響致病力，可能與多聚半乳糖醛酸酶在真菌基因組中往往是以多基因家族存在，并且有些基因還是多拷貝的或者具有多種翻譯后修飾有關(guān)。轉(zhuǎn)反義PG基因番茄果實(shí)抗病性提高，進(jìn)而提高其商品價(jià)值。轉(zhuǎn)反義PG基因番茄果實(shí)的這個(gè)性質(zhì)，主要是由于PG活性被很大程度地抑制，果膠降解減慢，較好地維持了果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使病原微生物不易侵入果實(shí)，從而增強(qiáng)抗病性。