董 錚，戴陽朔，李 魏，戴良英

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科學技術(shù)學院，湖南農(nóng)業(yè)大學作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上種植廣泛的糧食作物，它是地球上半數(shù)以上人口的重要主食。低溫作為一種滲透型非生物脅迫，嚴重制約水稻的生長和產(chǎn)量。水稻在受到低溫脅迫時，細胞內(nèi)主要有兩類蛋白質(zhì)分子在發(fā)揮作用：一類是直接保護細胞的滲透調(diào)節(jié)功能蛋白；另一類就是參與脅迫信號傳導和表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件的結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)生作用的機理不同，將它們分成很多個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中CBF/DREB（C-repeat binding factor/dehydrationresponsive element binding）類、MYB（ν-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）類、bZIP（basic region/leucine zipper）類和 NAC（NAM，ATAF1-2，CUC2）類轉(zhuǎn)錄因子就是水稻低溫脅迫信號傳導中發(fā)揮重要作用的4個家族。

1 CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子

CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）基因家族中的ERF亞家族[1]。AP2/ERF是一個巨大的基因家族，廣泛的存在于各種植物中，僅在水稻中，就擁有188個AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子通過自身包含的RAYD保守結(jié)構(gòu)域特異識別干旱和冷誘導響應順式元件DRE/CRT后與之結(jié)合并激活下游基因，在植物適應干旱、高鹽和低溫等非生物逆境過程中起著非常重要的作用[4-5]。

近幾年，Dubouzet等[6]在水稻中分離出了5個與擬南芥（Arabidopsis thaliana）中DREB的同源基因，分別是 OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D和 OsDREB2A，其中 OsDREB1A和OsDREB1B受冷誘導表達。同時，Dubouzet等在擬南芥中超表達OsDREB1A，可以誘導與擬南芥DREB1A轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的目標基因表達，提高擬南芥對干旱、高鹽和冷脅迫的耐受性。這些結(jié)果表明OsDREB1A與DREB1A具有相似的功能。而Mao等[7]鑒定了10個水稻CBF/DREB同源基因，其中 6個基因（OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1E，OsDREB1F 和 OsDREB1G）在水稻基因組中的位置與擬南芥CBF1-CBF4的位置具有共線性和相似的表達模式，并參與冷信號基因的共表達，表明這些基因可能也參與了水稻的冷馴化過程。

2 MYB類轉(zhuǎn)錄因子

MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物組織細胞中廣泛存在，它們在調(diào)控抗非生物和生物脅迫信號方面起到重要作用。根據(jù)這些蛋白DNA結(jié)合域上重復串聯(lián)序列的數(shù)目不同，MYB類轉(zhuǎn)錄因子可分成3種類型：結(jié)合單個特異重復序列的R1型、2個序列的R2R3型和3個序列的R1R2R3型[8]。

R1型轉(zhuǎn)錄因子在冷馴化過程中起調(diào)控作用的報道不多，而其中最有代表性的是Lu等[9]發(fā)現(xiàn)的MYBS3。MYBS3的DNA結(jié)合域能特異性的與α-淀粉酶基因（aAmy3）啟動子區(qū)TA-box（TATCCA）結(jié)構(gòu)結(jié)合。Su等[10]研究表明，MYBS3的轉(zhuǎn)錄水平被冷脅迫誘導上調(diào)，他們分別構(gòu)建了該基因的超表達和RNAi的轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)超表達MYBS3能提高水稻耐冷性，而干涉MYBS3的表達會讓水稻對冷脅迫更加敏感，說明MYBS3在水稻耐寒中起重要作用。該研究同時發(fā)現(xiàn)MYBS3能在轉(zhuǎn)錄水平上抑制水稻中已知的CBF/DREB冷信號傳導通路中的DREB1類蛋白，與CBF/DREB信號途徑對寒冷的快速應答不同，MYBS3所在的冷信號通路應答緩慢，但作用更為持久。植物中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子多數(shù)為R2R3型，這類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長、抗逆和激素調(diào)節(jié)等方面起重要作用[11]。其中，Os－MYB2是一個典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。Yang等[12]研究表明，超表達OsMYB2的轉(zhuǎn)基因水稻對鹽分、冷害和干旱的耐受性增加，并能上調(diào)編碼脯氨酸合成酶和運輸?shù)鞍椎谋磉_，而脯氨酸在細胞中的積累能明顯提高植物對低溫脅迫的耐受性。超表達OsMYB2也能讓植株中的脅迫相關(guān)基因如OsLEA3，OsRab16A，OsDREB2A表達出現(xiàn)上調(diào)。相對于R2R3型，植物中的R1R2R3型的MYB類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量要少得多。OsMYB3R-2就是一個R1R2R3型的轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白與有絲分裂特異激活因子順式作用元件（T/C）C（T/C）AACGG（T/C）（T/C）A結(jié)合。OsMYB3R-2在水稻中能被寒冷、干旱和高鹽脅迫誘導表達，若將水稻OsMYB3R-2在擬南芥中超表達，與冷相關(guān)的上游基因如DREB2A，COR15a，RCI2A等表達量都顯著提高，說明OsMYB3R-2能通過激活冷應答基因的表達來提高對冷脅迫的耐受性，而且該蛋白處在冷信號途徑中的上游位置[13]。

3 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子

bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中是最保守、分布最廣的一類轉(zhuǎn)錄因子，目前在水稻中已發(fā)現(xiàn)94個成員[14]。該類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征是在N端有一個由20個堿性氨基酸組成的能與特異DNA序列結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，緊挨著堿性結(jié)構(gòu)域的是一個亮氨酸結(jié)構(gòu)域，其特點是每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，該結(jié)構(gòu)能形成二聚體并結(jié)合DNA。bZIP類轉(zhuǎn)錄因子能特異識別核心序列為ACGT的順式作用元件，包括 CACGTG（G 盒），GACGTC（C盒），TACGTA（A盒）。很多ABA誘導的啟動子中都含有這類元件。在脅迫條件下，bZIP轉(zhuǎn)錄因子與ABA信號響應基因的啟動子區(qū)ABRE（ACGTGCG）結(jié)構(gòu)結(jié)合并啟動下游基因的表達[15]。

研究人員很早就發(fā)現(xiàn)水稻LIP19蛋白是一個由148氨基酸組成的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，受低溫脅迫誘導表達[16]。后來Shimizu等[17]發(fā)現(xiàn)它缺失bZIP類蛋白常有的同源二聚化和結(jié)合DNA的能力，這一點與哺乳動物的Fos蛋白相同。他們通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)了另一個與LIP19互作的受低溫誘導的bZIP蛋白OsOBF1。該蛋白形成的同源二聚體能特異的結(jié)合到序列ACGTCA上。OsOBF1和LIP19能形成異源二聚體結(jié)構(gòu)，這種互作的形式要比OsOBF1自身形成同源二聚體的作用要強。因此水稻中可能存在一種感溫模型：在25℃降低到5℃這個過程里，OsOBF1表達量由高到低，而LIP19表達量由低到高，細胞內(nèi)的OsOBF1同源二聚體逐漸轉(zhuǎn)變成由OsOBF1和LIP19形成的異源二聚體，導致特異結(jié)合的DNA種類發(fā)生變化，最終誘導特異的耐寒基因，完成植物自身對環(huán)境的反饋調(diào)節(jié)。

4 NAC類轉(zhuǎn)錄因子

NAC類轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在，水稻中就發(fā)現(xiàn)有149個[14]。NAC得名于發(fā)現(xiàn)在這類轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合區(qū)域上保守的前3個分別來自不同植物的蛋白，即NAM，ATAF1-2和CUC2[18]。這類轉(zhuǎn)錄因子所編碼的蛋白特點是在N端有一個非常保守的DNA結(jié)合區(qū)域，但在C端有不同的結(jié)構(gòu)，比如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨的數(shù)量不同[19]。

Hu等從旱稻IRA109中分離了一個響應低溫脅迫的NAC類轉(zhuǎn)錄因子：SNAC2。SNAC2蛋白包含NAM類的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并定位在細胞核中。超表達SNAC2的水稻增加了對寒冷、高鹽脅迫和聚乙二醇（PEG）模擬的干旱脅迫的耐受性，并且比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陮BA敏感。對超表達SNAC2的水稻進行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)有36個相關(guān)基因在常溫和低溫下表達量都上調(diào)了，同時有9個相關(guān)基因在常溫和低溫下表達量下調(diào)了，這些基因中編碼的蛋白部分在抗寒、抗旱和抗高鹽濃度作用上發(fā)揮了功能。

5 結(jié)語

近些年，植物轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能研究有很大的進展，它們在很多信號途徑中的作用都有新發(fā)現(xiàn)，這與轉(zhuǎn)錄因子在生物或非生物逆境條件下發(fā)揮重要作用密不可分。水稻中很多增強或減弱抗低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子同時也受其他逆境的誘導，特別是受非生物脅迫的情況比較常見，如干旱、高鹽脅迫，但病理、激素相關(guān)的生物脅迫也可誘導低溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子在何種信號途徑中起更重要的作用很多時候取決于該因子的DNA結(jié)合域的識別情況和效率。比如在CBF/DREB參與的耐寒途徑中，擬南芥中DREB1A蛋白結(jié)合ACCGAC和GCCGAC效率是一樣的，而水稻OsDREB1A蛋白更偏好于結(jié)合GCCGAC，說明OsDREB1A轉(zhuǎn)錄因子可能偏向于某一信號途徑[6]。雖然通過研究轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫過程中的作用，闡明植物抗逆信號傳導機制，以及利用轉(zhuǎn)錄因子提高植物抗逆性是解決植物在逆境條件下產(chǎn)量與質(zhì)量問題的有效途徑，但目前還沒有特別成熟的抗性品種。這可能是因為各個抗逆信號途徑之間存在復雜的交聯(lián)信號網(wǎng)絡，因此進一步分析轉(zhuǎn)錄因子在關(guān)聯(lián)各種抗逆信號網(wǎng)絡上的作用機制具有重要意義。

[1]Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，290（3）：998-1009.

[2]Velasco R，Zharkikh A，Affourtit J，et al.The genome of the domesticated apple（Malus× domestica Borkh.）[J].Nature Genet，2010，42：833-839.

[3]張計育，王慶菊，郭忠仁.植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子研究進展[J].遺傳，2012，34（7）：835-847.

[4]Okamuro J K，Caster B，Villarroel R，et al.The AP2 domain of APETALA2 define a large new family of DNA binding protein in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（13）：7076-7081.

[5]Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，low-temperature，or high-salt stress[J].Plant Cell，1994，6（2）：251-264.

[6]Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，et al.OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activators that function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression[J].The Plant Journal，2003，33（4）：751-763.

[7]Mao D，Chen C.Colinearity and similar expression pattern of rice DREB1s reveal their functional conservation in the cold-responsive pathway[J].PLoS ONE，2012，7（10）：e47275.

[8]Jin H L，Martin C.Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family[J].Plant Mol Biol，1999，41：577-585.

[9]Lu C A ，Ho T D，Ho S L，et al.Three novel MYB proteins with one DNA binding repeat mediate sugar and hormone regulation of a-amylase gene expression[J].Plant Cell，2002，14：1963-1980.

[10]Su C F，Wang Y C，Hsieh T H，et al.A novel MYBS3-dependent pathway confers cold tolerance in rice[J].Plant Physiology，2010，153：145-158.

[11]Park M R，Yun KY，Mohanty B，et al.Supra-optimal expression of the cold-regulated OsMyb4 transcription factor in transgenic rice changes the complexity of transcriptional network with major effects on stress tolerance and panicle development[J].Plant，Cell&Environment，2010，33（12）：2209-2230.

[12]Yang A，Dai X，Zhang W H.A R2R3-type MYB gene，Os－MYB2，is involved in salt，cold，and dehydration tolerance in rice[J].Journal of Experimental Botany，2012，63（7）：2541-2556.

[13]Dai X，Xu Y，Ma Q，et al.Overexpression of an R1R2R3 MYB Gene，OsMYB3R-2，increases tolerance to freezing，drought，and salt stress in transgenic Arabidopsis[J].Plant Physiology，2007，143（4）：1739-1751.

[14]Xiong Y，Liu T，Tian C，et al.Transcription factors in rice：A genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots[J].Plant Mol Biol，2005，59：191-203.

[15]Choi H，Hong J，Ha J，et al.ABFs，a family of ABA-responsive element binding factors[J].Biol Chem，2000，275：1723-1730.

[16]Aguan K，Sugawara K，Suzuki N，et al.Low-temperature-dependent expression of a rice gene encoding a protein with a leucine-zipper motif[J].Molecular and General Genetics，1993，240（1）：1-8.

[17]Shimizu H，Sato K，Berberich T，et al.LIP19，a basic region leucine zipper protein，is a fos-like molecular switch in the cold signaling of rice plants[J].Plant and Cell Physiology，2005，46（10）：1623-1634.

[18]Aida M，Ishida T，F(xiàn)kaki H，et a1.Genes involved in organ separation in Arabidopsis，analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J].Plant Cell，1997，9：841-857.

[19]Olsen A N，Ernst H A，Leggio L L，et a1.NAC transcription factors：structurally distinct，functionally diverse[J].Trends in Plant Sci，2005，10（2）：79-87.