黃華波，譚周進(jìn)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase）是一類α-轉(zhuǎn)糖苷酶，能以蔗糖為受體底物，在無其它物質(zhì)參與反應(yīng)時生成α-葡聚糖，當(dāng)有可識別的外源受體存在時，也能將葡糖基轉(zhuǎn)移給外源受體而生產(chǎn)各種糖基化產(chǎn)物。因葡聚糖蔗糖酶反應(yīng)的特異性、產(chǎn)物的多樣性以及對于產(chǎn)物合成的可操作性而使其成為生物催化合成中一種重要的工具酶。在飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

1 葡聚糖蔗糖酶的種類與特性

通常蔗糖轉(zhuǎn)糖苷酶（Sucrose-utilizing transglucosidases）可以分為糖苷水解酶70 和13 兩個家族[1]，除淀粉蔗糖酶（Amylosucrases）屬于GH13 家族外，大多數(shù)葡聚糖蔗糖酶都屬于GH70 家族，淀粉蔗糖酶主要是一類酶促轉(zhuǎn)化合成淀粉的催化劑。它并非降解淀粉，而是將蔗糖合成與淀粉類似的多聚糖。葡聚糖蔗糖酶的主要反應(yīng)是產(chǎn)生胞外多聚糖，這些α-葡聚糖以不同類型的糖苷鍵相連，他們的結(jié)構(gòu)和分子量大小是由酶的特異性和產(chǎn)酶菌株決定的。根據(jù)產(chǎn)生不同多聚糖的類型，葡聚糖蔗糖酶可以分為5 類，這些不同的多聚糖特征一是分子量達(dá)到106 以上，另一個是D-葡糖基單位以不同的共價(jià)鍵連接，如α-1，6、α-1，3、α-1，4、α-1，2 糖苷鍵等。主要以α-1，6 鍵連接的多聚糖稱為Dextrans（右旋糖苷），生產(chǎn)此類的酶稱為Dextransucrases（右旋糖酐蔗糖酶DSR），主要發(fā)現(xiàn)在明串珠球菌屬；Mutansucrases 主要分離自鏈球菌屬，合成α-1，3 鍵型葡聚糖，稱為Mutan，通過加強(qiáng)鏈球菌在牙齒表面的定植和吸附而在齲齒的形成中扮演重要角色；Reuteransucrases，主要發(fā)現(xiàn)在乳酸菌屬，產(chǎn)生葡聚糖主要是α-1，4 和α-1，6 鍵；Alternansucrases，主要由明串珠球菌屬產(chǎn)生，合成非典型的α-1，3 與α-1，6 交替的葡聚糖，稱為Alternan；Amylosucrases（淀粉蔗糖酶），來自于GH13 家族，主要發(fā)現(xiàn)于奈瑟氏菌屬、異常球菌屬和交替單胞菌屬，產(chǎn)生一個由α-1，4 鍵構(gòu)成的與淀粉高度相似的多聚糖[2-4]。

葡聚糖蔗糖酶可由不同的菌種產(chǎn)生，這些菌屬包括：明串珠菌屬、乳酸菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、異常球菌屬、奈瑟氏菌屬、交替單胞菌屬、假單胞菌屬和雙歧桿菌屬。

2 酶的催化反應(yīng)機(jī)制與結(jié)構(gòu)分析

在酶促低聚糖的合成途徑中，葡聚糖蔗糖酶不需要添加糖核苷酸或1-磷酸葡萄糖，僅以蔗糖的分解供能就能合成需要的糖苷，在經(jīng)濟(jì)上具有無可比擬的優(yōu)勢。一般來說，主要的催化反應(yīng)包含2 個步驟。第一步（葡萄糖基步驟），親核殘基表現(xiàn)出對糖基環(huán)變旋異構(gòu)效應(yīng)的碳原子進(jìn)行親核攻擊，并且同時，催化酸（谷氨酸）使蔗糖供體配糖體的氧原子質(zhì)子化。這就導(dǎo)致了一個β-D-葡糖基酶共價(jià)中間體的形成和果糖的釋放；第二步（去葡萄糖基步驟），通過去質(zhì)子化的羧酸基團(tuán)攻擊糖苷環(huán)異頭C1原子與天冬氨酸之間的共價(jià)鍵而將葡糖基分子轉(zhuǎn)移給活性受體[5]。除了生成低聚糖外，通過葡糖基復(fù)合體構(gòu)造的逆反應(yīng)還能產(chǎn)生蔗糖同分異構(gòu)體。

來源不同的葡聚糖蔗糖酶結(jié)構(gòu)上都具有高度的相似性，比如GH13 家族和GH70 家族的酶體系構(gòu)架采?。é?α）8管狀結(jié)構(gòu)[6]，是由8 個平行的β 折疊形成的內(nèi)部β 管被8 個α 螺旋圍繞所形成，因此單個的α 螺旋和β 折疊相互交替并以環(huán)形連結(jié)。然而兩者活性中心的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也顯示了明顯的差異。在20 世紀(jì)90年代，人們就已經(jīng)克隆出葡聚糖蔗糖酶GTF-I 全基因片段，并在體外成功表達(dá)出高純度的GTF-I，從而也對該酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)做出了預(yù)測。直到2008年，Dijkstra 等才成功的捕捉到GTF180 葡聚糖蔗糖酶的晶體結(jié)構(gòu)，從而也證實(shí)更早對于（β/α）8管狀結(jié)構(gòu)的預(yù)測。2011年，日本靜岡縣立大學(xué)、東京大學(xué)等聯(lián)合機(jī)構(gòu)首先通過人工方法大量制造出來自于口腔鏈球菌的葡聚糖蔗糖酶GTF-SI，隨后使其結(jié)晶，并通過X 射線進(jìn)行分析，首次弄清楚了導(dǎo)致齲病的葡聚糖蔗糖酶的立體結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)，盡管該酶與α-淀粉酶結(jié)構(gòu)類似，但它存在淀粉酶中并沒有的螺旋結(jié)構(gòu)部分，推測就是這些部分參與了葡聚糖的制造[7]。

3 葡聚糖蔗糖酶的外源受體反應(yīng)

除了體系中只存在蔗糖的反應(yīng)外，當(dāng)一個羥基化受體，如一個糖、一個酒精、一個多元醇或者一個黃酮類物質(zhì)加入到反應(yīng)混合物中，葡聚糖蔗糖酶的催化活性能夠從天然反應(yīng)重新定向?yàn)闉檫@些外源受體轉(zhuǎn)糖基，如果這些受體能夠被酶很好的識別的話[8]。研究顯示，一些受體物質(zhì)被糖基化后，其穩(wěn)定性、溶解性或生物利用度等顯著增加[9-12]。

從20 世紀(jì)50年代開始，人們就知道葡聚糖蔗糖酶能夠催化外源受體發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。短的葡糖基低聚糖通過二糖的延伸而形成，這些二糖有麥芽糖、異麥芽糖、黑曲霉糖和龍膽二糖。葡糖基化反應(yīng)產(chǎn)率與酶對受體分子的識別和反應(yīng)條件有關(guān)。工業(yè)上，DSR-S 利用外源底物合成一系列與低聚麥芽糖類似的低聚半乳糖，和工業(yè)生產(chǎn)從淀粉降解得到的低聚麥芽糖酶促轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)生的低聚麥芽糖苷有結(jié)構(gòu)的類似性，這些產(chǎn)物是日本市場上出現(xiàn)的主要益生元成分。DSR-E 是來自于腸明串珠菌NRRL B-1299 的一種葡萄聚糖蔗糖酶，合成一種包含29% α-1，2 糖苷鍵的葡萄聚糖，當(dāng)用麥芽糖作受體時，這種特異性得到維持，結(jié)果產(chǎn)生一系列在非還原末端包含或不包含α-1，2 糖苷鍵的低聚糖，這種低聚半乳糖不能被人和動物的消化酶所消化，以動物模型進(jìn)行的研究顯示，他們能夠被來自于人腸道微生物區(qū)系的細(xì)菌所代謝，因此被應(yīng)用于皮膚美容中用于維持皮膚微生物區(qū)系的平衡[13]。

除了麥芽糖和異麥芽糖，來自明串珠菌屬葡聚糖產(chǎn)生菌NRRL B21297 的交替蔗糖酶被發(fā)現(xiàn)能以龍膽二糖作為底物合成糖基化龍膽二糖，是一種潛在的益生元，而且沒有龍膽二糖的苦味[14]。更有趣的是，葡聚糖蔗糖酶還可以利用許多外源的底物來合成不同的糖苷，這些底物包含糖類（半乳糖、木糖、鼠李糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺），芳香族物質(zhì)（兒茶素、木犀草素、槲皮苷、楊梅酮），醇類（鄰羥基苯甲醇、不同鏈長的主要醇類）和氨基酸衍生物等[15-17]。

2000年Hartmans 等[18]系統(tǒng)研究了變形鏈球菌GS-5 株GTF-D 非糖基受體特異性和反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，二羥基芳香烴化合物如鄰苯二酚、4-甲基鄰苯二酚和3-甲氧基鄰苯二酚都能夠被GTF-D 高效的轉(zhuǎn)糖基，當(dāng)糖受體濃度為40 mmol/L，且以200 mmol/L 蔗糖作為糖供體反應(yīng)時，以上化合物糖基化產(chǎn)率分別為65%、50%和75%。3-甲氧基間苯二酚也能夠被轉(zhuǎn)糖基，但效率極低，許多其它的芳香族化合物如苯酚、間羥基苯甲醛、間苯二酚等不能夠被GTF-D 轉(zhuǎn)糖基。因此可以推斷GTF-D 芳香族受體需要2 個相鄰的羥基基團(tuán)。同時還研究了各種親水性的有機(jī)化合物作為助溶劑以促進(jìn)難溶于水的糖受體的轉(zhuǎn)糖基作用。選擇黃酮類兒茶素作為一個模式受體，二乙二醇二甲醚（MEE）作為可用的助溶劑。當(dāng)反應(yīng)體系中添加15% MEE 時，黃酮類兒茶素轉(zhuǎn)糖基效率提高4 倍，其水中溶解度提高12 倍，10%～30%的MEE 同時也能夠用于兒茶酚、4-甲基鄰苯二酚、3-甲氧基鄰苯二酚的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中，但過高的受體濃度有時候能夠使酶失活而抑制反應(yīng)。

4 酶工程改造與方法

當(dāng)天然的葡聚糖蔗糖酶用于大規(guī)模的工業(yè)合成來生產(chǎn)各種低聚糖或糖基化產(chǎn)物時，往往會因?yàn)槊傅牡孜锾禺愋浴⒎€(wěn)定性或催化效率等因素而受到限制。為了克服這些限制因素?cái)U(kuò)充酶的工業(yè)應(yīng)用，近年來發(fā)展的蛋白質(zhì)工程方法能對酶的催化特性進(jìn)行改造而提供了一種全新的手段。人們期望酶可以高效的合成設(shè)定的產(chǎn)物，并且盡量減少副反應(yīng)。酶工程策略也叫定向進(jìn)化，是基于通過隨機(jī)突變或重組建立突變體文庫，并用合適的方法進(jìn)行選擇，最終得到功能改進(jìn)的酶。這些方法的優(yōu)勢是不需要弄清楚酶的三維結(jié)構(gòu)，就能夠顯著的檢測到酶對特定底物的活性和其它的特性如溶解度和熱穩(wěn)定性等的提高。

Vander Veen 等[19]采用易錯PCR 進(jìn)行基因重組并通過選擇性篩選能夠從多糖奈瑟菌中產(chǎn)生更高效的、差異性的淀粉蔗糖酶。從突變體文庫使用只含有蔗糖作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基來篩選得到具有淀粉蔗糖酶活性的克隆。結(jié)果表明，其中最好的分離酶種N387D 催化效率提高了3 倍，另一個改進(jìn)的酶E227G 相對于野生型酶能夠合成更長的淀粉鏈。這個小組還從一個含有60 000 個克隆的突變體文庫中，篩選出3 株淀粉蔗糖酶的重組酶（2 株雙突變和1 個單突變），顯示他們在50℃的熱穩(wěn)定性相對于野生型提高了3.5～10 倍。半衰期活性最好的突變株在50℃能夠保持32 min，而野生型在這個溫度3 min 內(nèi)幾乎全部降解。在50℃，用改進(jìn)的突變體和高濃度蔗糖合成淀粉，相比在30℃的原酶能夠得到原來2 倍的淀粉鏈長度[20]。來自于GH70 家族的葡聚糖蔗糖酶的轉(zhuǎn)糖基活性也被定向進(jìn)化而得到提高了。用超軟X 射線照射腸膜明串珠菌B-742CB 葡聚糖蔗糖酶基因，產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶催化活性提高2.3 倍，并且目前酶合成更多重分枝的α-1，3 糖苷鍵的多聚糖[21]。

來源于腸膜明串珠菌NRRL B-1299 的葡聚糖蔗糖酶DSR-E，天然以α-1，6 和α-1，2 糖苷鍵合成，通過改造后得到的一個突變株能僅以α-1，2糖苷鍵合成[22]。使用一個半理性的改造方法，對來自于鏈球菌的GTF-R 靠近過度穩(wěn)定區(qū)域的2 個氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行修飾，最終該酶的催化特異性從α-1，6 鍵轉(zhuǎn)為α-1，3 鍵，同時它的轉(zhuǎn)糖基效率和活性都得到保留。野生型GTF-R 主要合成α-1，6 糖苷鍵（超過62%）產(chǎn)物，而突變體則主要以α-1，3 糖苷鍵（超過46%）合成葡聚糖多聚物[23]。有時候通過改變葡聚糖蔗糖酶其中的一個氨基酸，它就能從合成多聚糖改為合成低聚糖。從腸膜明串珠菌NRRL B-512F 產(chǎn)生的DSR-S 和DSR-T5 首先對受體結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，然后將2 個酶重組得到單個酶突變體GS，可以產(chǎn)生與父母代合成的結(jié)構(gòu)有差異的葡聚糖。試驗(yàn)表明，重組酶能夠產(chǎn)生包含α-1，6、α-1，3 和α-1，4 鍵的水溶性葡聚糖[24]。

5 總結(jié)與展望

上述研究表明，通過葡聚糖蔗糖酶的天然反應(yīng)，可以用可再生原料來生產(chǎn)各種不同類型的葡聚糖、葡糖基低聚糖和葡糖基衍生物。目前已經(jīng)能夠把葡聚糖蔗糖酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究與蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展相結(jié)合，從而使它的功能和應(yīng)用得到極大的提高。新的葡聚糖蔗糖酶能夠發(fā)生自然界不存在的與之等價(jià)的酶所催化的反應(yīng)以及表現(xiàn)出新的特征，從而人們利用這個催化工具來生產(chǎn)更多的生物活性糖苷（例如抗生素、激素、甜味素、生物堿、黃酮類等）。這種巨大的潛能甚至能夠讓人們設(shè)想葡聚糖蔗糖酶β-糖苷鍵產(chǎn)物的出現(xiàn)。

采用何種方法來擴(kuò)充葡聚糖蔗糖酶在生物合成中的應(yīng)用？又將遵循什么樣的指導(dǎo)方法來完成這個目標(biāo)呢？首先，要想更深入在分子水平了解葡聚糖蔗糖酶的特性，將需要得到酶的大量的三維立體結(jié)構(gòu)信息，必須在能夠?yàn)楣こ堂傅睦硇栽O(shè)計(jì)提供更多必要信息方面做最大的努力。然而，酶工程策略的成功也很大程度上依賴于有效的檢測方法的設(shè)計(jì)，從而從大量的文庫中分離出需要的突變體。這就意味著需要設(shè)計(jì)更多自動化的和敏感的檢測實(shí)驗(yàn)方法。另一個具有挑戰(zhàn)性的方面是對于酶工程的快速、預(yù)測性設(shè)計(jì)缺少必要的酶系統(tǒng)動力學(xué)信息。對于酶結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面突變效應(yīng)的預(yù)測仍是一個難題。分子動力學(xué)、蛋白質(zhì)模擬以及底物動力學(xué)相結(jié)合的生物物理技術(shù)構(gòu)象變化的應(yīng)用依然受困。多學(xué)科綜合無疑將促進(jìn)這個領(lǐng)域的重大發(fā)展，計(jì)算機(jī)技術(shù)在提高酶的重組效率方面扮演重要角色，新技術(shù)的應(yīng)用將提高酶的表達(dá)、效率、穩(wěn)定性和專一性，也就是說，改造出理想的葡聚糖蔗糖酶為更好的生物催化所利用。

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