尚 娜，周志軍

（1.河北大學 圖書館，河北 保定 071002；2.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

實驗教學是理工科高等教育的重要組成部分，是培養(yǎng)高質量科學人才的關鍵。傳統(tǒng)的實驗教學依附于理論課，受限于實驗學時的安排，由一個個相互孤立的、小而散的實驗項目組成。在實驗內容方面，以驗證性為主，內容陳舊呆板［1］。進入21世紀，許多高校都嘗試對實驗教學，主要包括實驗教學體系、結構、內容進行了改革，構建符合素質教育和人才發(fā)展的開放創(chuàng)新實驗教學模式［2－4］，一些學者提出將科研成果移植為實驗項目，服務于實驗教學［5－6］。適時地選擇一些科研成果，將其轉化為專題實驗，使學生能夠全程參與一項完整的科研過程，對于培養(yǎng)學生的動手能力、分析解決問題能力和創(chuàng)新能力具有重要意義。

1 科研成果服務生命科學專題實驗教學舉例

1.1 專題實驗內容選擇

2003年，加拿大生態(tài)學家Herbert等提出DNA條形碼概念（DNA Barcoding），針對形態(tài)學分類固有的缺陷，如表型可塑性和遺傳可變性、無法鑒定隱存分類單元、不同發(fā)育階段的物種、不完整的生物體組織碎片等，Herbert倡導利用線粒體COⅠ基因5′端長度為658bp的標準基因片段在DNA水平上進行物種區(qū)分，構建全球性的物種鑒別平臺［7－8］。

1.2 實驗內容及安排

1.2.1 儀器、試劑與材料

儀器：PCR擴增儀、冷凍高速臺式離心機、超凈工作臺、微量移液器、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、恒溫金屬浴等分子生物學實驗室常規(guī)設備。

試劑：蛋白酶 K、rTaq聚合酶、dNTPs、DNA Marker、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、EB（溴化乙錠）、Na2EDTA（乙二銨四乙酸鈉鹽）、Tris平衡酚、瓊脂糖、無水乙醇、氯仿、SDS等。

材料：新鮮標本、酒精浸泡標本或干制針插標本等。

1.2.2 總DNA提取

取標本足股節(jié)肌肉，采用酚－氯仿抽提法，參考田英芳等（1999）提出的方法提取總 DNA［9］。具體步驟為：

（1）配制裂解液。A︰B︰C＝8︰1︰1（A液：0.05MTris，0.1MNaCl，0.1MNa2EDTA，pH 7.0～8.0；B液：5%SDS；C液：2mg／mL蛋白酶K）；

（2）編號。要求簡單、實驗室唯一、有一定的自明性、取材后的憑證標本與提取所使用離心管相對應。

（3）取材。用無菌眼科剪刀剪開后足股節(jié)表皮，用鑷子夾取適量肌肉組織放入盛有600μL裂解液的離心管中，經剪刀反復剪碎、研磨后，加入1 μLRNA酶。

（4）消化。65℃水浴1～2h，至消化液變清亮。

（5）酚抽提。加入等體積Tris平衡酚，上下緩慢顛倒混勻，8000r／min離心10min，取上清，并重復1次。

（6）氯仿抽提。加入等體積氯仿／異戊醇混合液（24︰1），上下緩慢顛倒混勻，8000r／min離心10 min，取上清。

（7）沉淀DNA。加入2倍體積的冰無水乙醇，在冰箱中放置20min以沉淀DNA，12000r／min離心15min，棄上清；再加入1mL 70%冰乙醇洗滌DNA，12000r／min離心15min，棄上清。

（8）自然干燥后，溶解于50μL無菌雙蒸水。

（9）電泳檢測。1%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，紫外成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 PCR擴增

選用DNA條形碼通用引物：LCO1490：5’－GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G －3’和HC02198：5’－TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA －3’進行擴增［10］。參考 TaKaRa rTaq聚合酶使用說明，配置反應體系（25μL），其中10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，模板DNA 3μL，引物各3μL，酶0.25μL，加超純水補齊。PCR擴增反應的參數為：94℃預變性3min；94℃變性15s，49℃退火20s，70℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切取目標條帶后使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收后，送測序公司進行直接測序或連接到T載體中進行克隆測序。

1.2.4 數據處理

測序公司提供的測序結果通常是abi格式，雙向測序結果經Lasergene 6中的SeqMan軟件進行峰圖校正和拼接，最終以fasta格式輸出［11］。為避免核基因組中Numts干擾，首先使用Lasergene 6中的Editseq軟件［11］，選擇無脊椎動物線粒體密碼子表對序列進行翻譯，檢測是否存在由于堿基突變、插入／缺失導致的翻譯意外終止的Numts；然后使用ClustalX［12］經多重序列比對篩查存在堿基插入／缺失的Numts。最后使用 MEGA 4.0［13］計算序列的堿基組成（nucleotide composition）、變異位點（variable sites）、保守位點（conserved sites）、簡約信息位點（parsimony information sites）、自裔位點（singleton sites）、轉換與顛換的比例（Ts／Tv）、種內及種間kimura 2－parameter距離等，并采用K2P（kimuras 2parameter）模型，以鄰接法（neibor－joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育關系樹。

2 結束語

綜上所述，實驗教學是高等學校，特別是理工科院校教學的重要組成部分，是提高教學質量、培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和實踐能力的高素質人才不可缺少的重要環(huán)節(jié)。DNA條形碼研究實驗穩(wěn)定性、重現性好，具備很好的可操作性，綜合性強，適合生命科學專業(yè)高年級的實驗教學。通過開設DNA條形碼研究實驗，在實驗操作方面，可以使學生充分掌握DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴增、DNA瓊脂糖凝膠回收、PCR產物克隆測序等一系列分子生物學實驗技能；在數據處理方面，則可以使學生掌握引物設計、序列校對、拼接與注釋、GenBank數據庫序列提交、多重序列比對、堿基組成分析、系統(tǒng)發(fā)育樹重建等一系列分子系統(tǒng)學數據處理方法。這類基于科研成果移植而來的專題實驗教學，不但在很大程度上改變了傳統(tǒng)教學模式，更為重要的是探索出了一條創(chuàng)新性實驗教學的新思路。

（References）

［1］常春耘，陸南.實驗教學存在的問題及改革措施［J］.實驗室研究與探索，2006，25（2）：235－237，243.

［2］王慧琴，吳慶豐，梁曉軍，等.以應用為導向的大學物理實驗改革的探討［J］.實驗技術與管理，2012，29（9）：148－150.

［3］鄧友娥，顏志森.學術期刊輔助電子技術實驗教學探析［J］.實驗室研究與探索，2012，31（8）：329－331.

［4］潘涌璋，唐啟紅，張秋明，等.大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目管理模式探討［J］.實驗技術與管理，2012，29（6）：146－150.

［5］王英華，魏士剛，程新民，等.科研成果移植為化學創(chuàng)新教學實驗：分光光度法同時測定混合物中鉬、鎢含量［J］.實驗技術與管理，2007，24（9）：15－16，23.

［6］于兵川，吳洪特，童金強.科研成果轉化為實驗項目初探［J］.實驗室研究與探索，2009，28（1）：133－135.

［7］Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313－321.

［8］Hebert P D N，Ratnasingham S，deWaard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1divergences among closely related species［J］.Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences（Suppl.），2003，270：96－99.

［9］田英芳，黃剛，鄭哲民，等.一種簡易的昆蟲基因組DNA提取方法［J］.陜西師范大學學報：自然科學版，1999，27（4）：82－84.

［10］Folmer O，Black M，Hoeh W，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates［J］.Mol Mar Biol Biotechnol，1994，3（5）：294－299.

［11］Burland T G.DNASTAR’s Lasergene sequence analysis software［J］.Methods Mol Biol，2000（132）：71－91.

［12］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL＿X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Res，1997，25（24）：4876－4882.

［13］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Mol Biol Evol，2007，24（8）：1596－1599.