李微微 （黑龍江省七臺(tái)河市畜牧獸醫(yī)局 154699）

釀酒酵母是一種重要的模式生物[1]，具有廣泛的科研應(yīng)用價(jià)值。Nelson等研究表明,酵母的基因組中約有200多個(gè)基因與耐鹽有關(guān)[6]。釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育以及響應(yīng)外界環(huán)境和壓力變化都受到促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控[7]。Warmka J等測(cè)量了在用滲透壓處理前后的HOG1激酶的活性，結(jié)果顯示Ptc1在釀酒酵母對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中起著重要作用[10]。本文研究目的是為了通過(guò)觀察ptc1△缺失株在含有LiCL培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，來(lái)考察PTC1基因在細(xì)胞壁完整性中的功能。

1 材料與方法

1.1 BY4741和ptc1△菌株復(fù)蘇活化 取出凍存的釀酒酵母BY4741和ptc1△缺失株，用接種環(huán)在YPD培養(yǎng)基固體平板中劃線，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 不同濃度的培養(yǎng)基的制備 稱(chēng)取1.0g胰蛋白胨、2.0g葡萄糖、0.5g酵母抽提物、2.0g YPD瓊脂粉于三角錐瓶中，加入預(yù)先配制的10ml 4M的LiCL溶液，再加入90ml蒸餾水溶解至清亮，即為含有終濃度為0.4M LiCL的YPD固體培養(yǎng)基。按照此種方法配制其他含不同濃度的LiCL YPD培養(yǎng)基。121℃高壓滅菌20min后，無(wú)菌超凈臺(tái)中制備平板。

1.3 菌株劃線培養(yǎng) 按照三線法，將BY4741和ptc1△缺失株在YPD+0.1M LiCl，YPD+0.2M LiCl，YPD+0.3M LiCl，YPD+0.4M LiCl平板上劃線，同時(shí)以YPD平板做對(duì)照，劃線后的平板倒置培養(yǎng)箱中，30℃下培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

按照示意圖所示，劃線培養(yǎng)的菌株生長(zhǎng)情況顯示，ptc1△缺失株在含有0.1M和0.2M LiCl的YPD平板上的生長(zhǎng)速度比野生型慢，但其生長(zhǎng)情況大體上與野生型是一致的(圖1、圖2)。但是當(dāng)LiCl的濃度上升至0.3M時(shí)ptc1△缺失株已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的生長(zhǎng)缺陷(圖3)，而當(dāng)濃度繼續(xù)提高至0.4M時(shí)，這種濃度的LiCl對(duì)ptc1△缺失株已經(jīng)有致死的毒作用(圖4)。這說(shuō)明如果菌株缺失掉PTC1基因?qū)?huì)使菌株對(duì)含鹽環(huán)境的適應(yīng)能力下降，ptc1△缺失株在含鹽的情況下會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷。0.3M的LiCl是ptc1△缺失株的敏感濃度而0.4M的LiCl已經(jīng)可以對(duì)ptc1△缺失株起到致死作用。

圖1 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.1 M LiCl的YPD平板(30)℃生長(zhǎng)2d的情況

圖2 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.2M LiCl的YPD平板(30℃)上生長(zhǎng)4d的情況

圖3 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.3M LiCl的YPD平板(30)℃上生長(zhǎng)4d的情況

圖4 BY4741和ptc1△缺失株在含有0.4M LiCl的YPD平板(30)℃上生長(zhǎng)4d的情況

3 討論

在釀酒酵母中MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)至少調(diào)控6種不同的生理反應(yīng)[8]。HOG途徑是細(xì)胞在高鹽等高滲透壓的環(huán)境條件下通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)合成和貯存甘油來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓的一種途徑[9]，Warmka J等研究發(fā)現(xiàn)PTC1基因被敲除后，在外界滲透壓的誘導(dǎo)下，HOG1的活性會(huì)因?yàn)槭TC1的阻抑作用而不斷激增導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示釀酒酵母ptc1△缺失株在氯化鋰濃度達(dá)到0.3M時(shí)即出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)缺陷，這說(shuō)明PTC1確實(shí)在釀酒酵母對(duì)滲透壓的適應(yīng)過(guò)程中起作用。

[1]劉擎, 余龍.酵母: 一種模式生物[J].生命的化學(xué).2000, 20(2): 61-65.

[2]Nelson DE,Shen B,Bohnert HJ.Salinity tolerance-mechanisms,models and the metabolic engineering of complex traits[J].Genet Eng(NY), 1998, 20: 153-176.

[3]Haystead, TA, Weiel, DW, Litchfield, Y.Tsukitani, EJ and Krebs EG.Okadaic acid mimics the action of insulin in stimulating protein kinase activity in isolated adipocytes[J].Science, 1990, 265: 16571-16580.

[4]Warmka J, Hanneman J, Lee J, Amin D, Ota I.Ptc1, a type 2C Ser/Thr phosphatase, inactivates the HOG pathway by dephosphorylating the itogen-activated protein kinase Hog[J].Mol Cell Biol, 2001, 21: 51-60.

[5]Posas F, Saito H.Osmotic activation of the HOG MAPK pathway via stellp MAPKKK: scaffold role of pbs2p MAPK [J].Science,1997,276:1702-1705.

[6]Mapes, JamesOta, Irene M.Nbp2 targets the Ptc1-type 2C Ser/Thr phosphatase to the HOG MAPK pathway [J].2004, 23 (2): 302-11.