羅劍飛 林煒鐵

(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

百年來(lái)，作為生物硝化作用的限速步驟，由氨單加氧酶(AMO)催化的氨氧化反應(yīng)一直被認(rèn)為是一些化能自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(AOB)作用的結(jié)果;這些細(xì)菌主要包括來(lái)自β 變形菌綱的Nitrosomonas 和Nitrosospira屬的細(xì)菌和γ 變形菌綱Nitrosococcus 屬的細(xì)菌［1］.然而，通過(guò)對(duì)海洋和陸地環(huán)境中氨氧化作用的原位分析，發(fā)現(xiàn)很多氨氧化作用經(jīng)常在較低的底物濃度下進(jìn)行，而這些底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AOB 生長(zhǎng)所需的濃度，因此推測(cè)環(huán)境中還存在未知的氨氧化微生物［2］.

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們從構(gòu)建的海水等環(huán)境樣品的宏基因組文庫(kù)中篩選到了參與氮素循環(huán)的泉古菌的克隆子，并通過(guò)高通量的測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些古菌基因中含有編碼AMO 的基因，且與細(xì)菌AMO 基因類似，因此推測(cè)這些基因編碼的酶可能有氨氧化作用［3-5］.而隨著測(cè)序技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，在3 種目前已知的氨氧化古菌(AOA)的基因組序列中也發(fā)現(xiàn)含有類似細(xì)菌AMO 的基因［6-8］.因此，基于AOA 的AMO 亞基的基因amo A 的特異性引物和探針，發(fā)現(xiàn)amo A 廣泛分布于地球上各種環(huán)境中，包括海水、溫泉、土壤、河口、沉積物、動(dòng)物排泄物等，且很多環(huán)境中AOA 的數(shù)量是AOB 的幾倍甚至數(shù)千倍，特別是在一些低溶氧的環(huán)境中［9-15］.

AOA 的發(fā)現(xiàn)極大地豐富了氮的生物地球化學(xué)循環(huán)的知識(shí)，自AOA 和AOA amo 基因發(fā)現(xiàn)的不到十年間，國(guó)內(nèi)外已做了大量的研究，國(guó)內(nèi)也有多篇綜述報(bào)道［16-19］.本課題組長(zhǎng)期從事自然生態(tài)和人工生態(tài)中氮、硫、磷等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)的理論研究，通過(guò)對(duì)珠三角地區(qū)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氧化微生物的研究，發(fā)現(xiàn)該環(huán)境中AOB 主要由β 變形菌綱的Nitosomonas 和Nitrosospira 組成，AOA 主要來(lái)自于Candidatus Nitrososphaera gargensis［20-21］;通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIP)DNA 的研究，也進(jìn)一步證明了上述結(jié)論［22］;通過(guò)定量研究發(fā)現(xiàn)，該環(huán)境中古菌amo A 的數(shù)量是細(xì)菌amo A 的60～100 倍［23］.文中根據(jù)筆者對(duì)AOA 的研究及認(rèn)識(shí)，就當(dāng)前AOA 在菌株和富集物、系統(tǒng)發(fā)育、氨氧化和反硝化作用等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述.

1 AOA 菌株和富集物

2005年，K?nneke 等［6］通過(guò)富集和篩選的方法從熱帶海水水族缸中分離到了一株泉古菌SCM1，這是最早報(bào)道的一株可培養(yǎng)的AOA.SCM1 的基因序列與Nitrosopumilus maritimus 具有同源性，在此之前，N.maritimus 的amo A 基因在海水、海綿、污水處理系統(tǒng)、土壤等環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)［24-26］.N.maritimus SCM1 可以氨氮為唯一能源進(jìn)行生長(zhǎng)，并將NH+4轉(zhuǎn)化為，與AOB 相比，N.maritimus SCM1 的底物濃度閾值和半飽和常數(shù)是極其低的，對(duì)低氨氮濃度具有較強(qiáng)的適應(yīng)性［27］;N.maritimus SCM1 的這一生長(zhǎng)特性可以適應(yīng)各種寡營(yíng)養(yǎng)的海水或極端環(huán)境，因此也解釋了為何很多自然環(huán)境中AOA 的數(shù)量是AOB 的數(shù)十倍，甚至數(shù)萬(wàn)倍.

2011年，Tourna 等［28］從菜園土壤中富集和分離到了一株AOA，并命名為Nitrososphaera viennensis EN76，這也是迄今為止分離到的第二株可培養(yǎng)AOA，是唯一的一株來(lái)源于土壤的AOA 菌株.與海洋型N.maritimus SCM1 相比，N.viennensis EN76 生長(zhǎng)的最高濃度可達(dá)20 mmol/L，是N.maritimus SCM1的10 倍;除氨氮外，N.viennensis EN76 可以尿素為唯一能源進(jìn)行生長(zhǎng)，在其基因組中含有編碼脲酶的基因ureABCDEFG，這些基因也在Cenarchaeum symbiosum 中被發(fā)現(xiàn)［28-29］;而N.maritimus SCM1 由于缺乏編碼脲酶和轉(zhuǎn)導(dǎo)尿素的蛋白的基因，只能在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能利用尿素等有機(jī)氮源［30］.

AOA 匱乏的生長(zhǎng)條件和生理生化信息阻礙了從環(huán)境中獲取其純化的菌株.目前除可培養(yǎng)的N.maritimus SCM1 和N.viennensis EN76 外，通過(guò)富集的方法，分別從溫泉、土壤、沉積物、海綿等環(huán)境中得到了Candidatus N.gargensis、Nitrosocaldus yellowstonii HL72、Candidatus Nitrosopumilus NM25、Candidatus Nitrosoarchaeum koreensis MY1、Candidatus Nitrosoarchaeum limnia SFB1、Candidatus Nitrosoarchaeum limnia BG20、C.symbiosum、Candidatus Nitrosotalea devanaterra、Candidatus Nitrosopumilus salaria BD31、Archaeon SJ 的富集物(如表1 所示).盡管不是純培養(yǎng)物，但這些富集物中AOA 的豐度均較高，特別是Candidatus N.devanaterra 富集物，其AOA 細(xì)胞濃度高達(dá)99%，這樣的富集物可用于AOA 氨氧化等特性的研究.

表1 AOA 菌株和富集物的系統(tǒng)發(fā)育和基因組信息1)Table 1 Phylogenetic and genome information of AOA strains or enrichments

2 AOA 的系統(tǒng)發(fā)育

根據(jù)16S rRNA 基因的同源性，1990年Woese等［41］將已培養(yǎng)的嗜極端環(huán)境的古菌分為廣古菌門(Euryarchaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota).隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)古菌也廣泛分布在很多中溫環(huán)境和土壤環(huán)境中，這些古菌因此被稱為中溫泉古菌(mesophilic Crenarchaeota).這些中溫古菌多樣性大、豐度高，比較基因組學(xué)分析表明這些中溫古菌在古菌的系統(tǒng)發(fā)育中形成獨(dú)立的分支;根據(jù)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所有已知的AOA 都屬于這個(gè)分支.

2008年，Brochier-Armanet 等［42］基于核糖體蛋白氨基酸序列和16S rRNA 基因序列，將包括AOA在內(nèi)的中溫古菌從泉古菌門和廣古菌門分離，劃分為一個(gè)新的門，作為古菌域的第三個(gè)類群——Thaumarchaeota(如圖1 所示).

圖1 Thaumarchaeota 的系統(tǒng)發(fā)育［43］Fig.1 Phylogeny of Thaumarchaeota

張麗梅等［19］將Thaumarchaeota 譯為奇古菌門.自此，目前已知的AOA 中來(lái)源于溫泉的N.yellowstonii 歸為Group Ⅲ，N.gargensi 和來(lái)源于土壤的N.viennensis歸為Group 1.1b，來(lái)自海洋環(huán)境的C.symbiosum，N.maritimus，N.limnia 和來(lái)自農(nóng)田根際土壤的N.koreensis 被歸為Group 1.1a.Candidatus N.devanaterra 的16S rRNA 基因和amo A 基因與Group1.1a 的同源性高于Group1.1b，因此將其歸為Group1.1a，但與其他已知的Group1.1a 的序列比較又形成獨(dú)立的分支，因此最終將其歸為一類新的分支——Group1.1a-associated(如圖2 所示).

圖2 N.devanaterra 系統(tǒng)發(fā)育分析［40］Fig.2 Phylogenetic analysis of N.devanaterra.

3 AOA 與氨氧化作用

基于特異性核苷酸標(biāo)記16S rRNA 基因和amo A的研究，發(fā)現(xiàn)AOA 廣泛分布于土壤、沉積物、海洋、河口、淡水、熱泉、廢水處理系統(tǒng)等各種生態(tài)環(huán)境中.特別地，對(duì)這些基因豐度的研究結(jié)果表明，大多數(shù)生態(tài)中AOA 的數(shù)量是AOB 的數(shù)十幾倍甚至上萬(wàn)倍.海洋生態(tài)中AOA 多樣性高、分布廣、數(shù)量多，N.maritimus在一些海水中的數(shù)量占總海洋微生物數(shù)量的20%～30%［24-25］;同時(shí)，N.maritimus 和幾種海洋型AOA 表現(xiàn)出比AOB 高的氨氮親和力，可以在低氨氮濃度的環(huán)境中生長(zhǎng)代謝，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性［27，44］，豐度和氨氧化特性的研究表明，AOA可能是海洋中主要的氨氧化作用貢獻(xiàn)者.

然而在淡水和土壤環(huán)境中，AOA 和AOB 的豐度因生態(tài)環(huán)境而各異，它們的氨氧化能力受環(huán)境溫度、鹽度、溶解氧、氨氮濃度等理化因子的影響.Zhang等［45］利用12CO2和13CO2分別作為農(nóng)田土壤樣品中AOA 和AOB 的碳源，以amo A 和CO2固定的關(guān)鍵基因hcd 為標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)隨著富集的進(jìn)行，AOA 的13Camo A 和13C-hcd 基因的豐度增加，而AOB 的DNA中一直沒(méi)有檢測(cè)到13C-amo A，表明只有AOA 固定CO2進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng).Pratscher 等［46］同樣用13CO2分別作為農(nóng)田土壤樣品中AOA 和AOB 的碳源，amo A為標(biāo)記，開展了基于RNA 穩(wěn)定同位素的探測(cè)(RNASIP)，結(jié)果表明AOA 和AOB 都能固定CO2和氨氧化作用，而基于DNA 穩(wěn)定同位素探測(cè)(DNA-SIP)的結(jié)果表明只有AOB 而不是AOA 固定CO2進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，同樣的研究方法卻得到相反的結(jié)果.盡管很多研究證明了AOA 的氨氧化特性，但它們對(duì)環(huán)境中氨氧化作用的貢獻(xiàn)是否像它們的數(shù)量一樣，仍需要進(jìn)一步深入地研究.

4 AOA 與反硝化作用

N.maritimus SCM1 是最早分離得到的AOA，也是世界上公認(rèn)的AOA 模式菌株，研究者們以SCM1菌株出發(fā)進(jìn)行了其系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、代謝路徑、氨氧化動(dòng)力學(xué)等的研究和分析，相關(guān)研究工作如圖3(根據(jù)文獻(xiàn)［6，27，30，47］進(jìn)行繪制)所示.海洋環(huán)境中，溫室氣體一氧化二氮(N2O)的排放常被認(rèn)為是細(xì)菌硝化和反硝化作用的結(jié)果，AOB 在通過(guò)“硝化-反硝化”途徑將NH+4氧化為NO-2的過(guò)程中，同時(shí)將生成的NO-2還原為N2O［48］.基于SCM1 純菌株的研究表明:N.maritimus 在低溶氧條件下具有很高的N2O 釋放能力，而相同條件下AOB 生成N2O 的能力卻很低［49］;Santoro 等［49］利用穩(wěn)定同位素技術(shù)對(duì)AOA 的富集物進(jìn)行了研究，證明其在氨氧化的過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生N2O，AOA 對(duì)海洋環(huán)境N2O 產(chǎn)生的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于細(xì)菌的硝化和反硝化作用;對(duì)該富集物中AOA 的amo A 和16S rRNA 的基因分析表明，其與N.maritimus有很高的同源性［36］.這些研究說(shuō)明N.maritimus 等AOA 對(duì)自然界N2O 的產(chǎn)生起重要的作用，是海洋環(huán)境反硝化作用的主要貢獻(xiàn)者.

盡管對(duì)純培養(yǎng)物和富集物的研究證明了AOA具有釋放N2O 的功能，但至今在AOA 乃至古菌中仍未發(fā)現(xiàn)催化N2O 生成的酶，也未能在原位進(jìn)行AOA 氨氧化和反硝化的研究，也許基于基因組的生物信息學(xué)分析能揭開或預(yù)測(cè)AOA 氨氧化和反硝化的特性.通過(guò)分析N.maritimus SCM1 基因組，發(fā)現(xiàn)該菌缺少編碼羥胺(NH2OH)氧化還原酶的基因，推測(cè)AMO 催化NH+4氧化的過(guò)程中不產(chǎn)生NH2OH，而是生成一種類似硝酰基化合物(例如HNO)的中間產(chǎn)物，HNO 分子被氧化為NO-2 ，或轉(zhuǎn)化成N2O 溢出［47］.另外，在Nitrosopumilus sp.MY1 基因組中發(fā)現(xiàn)含有與反硝化有關(guān)的編碼亞硝酸鹽還原酶和一氧化氮氧化還原酶的基因［35］.

反硝化細(xì)菌通過(guò)nirK 編碼的亞硝酸鹽還原酶催化NO-2生成NO，是反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，AOB 中也發(fā)現(xiàn)有nirK，其編碼的NirK 通過(guò)反硝化途徑生成N2O［50-51］.有趣的是，在土壤Thaumarchaeota文庫(kù)［4］、環(huán)境宏基因組［52］和AOA 基因組序列［30，37］中都發(fā)現(xiàn)了與反硝化菌和AOB nirK 同源的基因序列.AOA 的NirK 序列與細(xì)菌NirK 僅有30%的相似性，雖然都是銅離子型的酶，但AOA 的NirK 序列在N-端可能編碼一個(gè)跨膜蛋白，在C-端有180 個(gè)氨基酸編碼的amicyanin 銅蛋白［53］.Lund 等［54］基于nirK序列研究了海洋和沿海環(huán)境中nirK 的多樣性和豐度，結(jié)果表明Thaumarchaeal nirK 的豐度是amo A 的10～100 倍，nirK 序列揭示的AOA 多樣性比amo A要高，說(shuō)明nirK 廣泛存在于AOA 中.該結(jié)果更進(jìn)一步證明了AOA 的反硝化特性.AOA 普遍具有生成N2O 的能力，它可能是海洋甚至陸地和淡水環(huán)境中N2O 釋放的主要?jiǎng)恿?

5 展望

基于特異性標(biāo)記16S rRNA 基因和amo A 的研究揭示了環(huán)境中AOA 的分布、多樣性、豐度、種群結(jié)構(gòu)等生態(tài)學(xué);基于純培養(yǎng)物和富集物的研究揭示了AOA 的氨氧化特性、反硝化特性等理化特性;基于基因組的研究揭示了AOA 的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育、物質(zhì)和能量代謝途徑等.AOA 的發(fā)現(xiàn)極大地豐富了生態(tài)環(huán)境中關(guān)于氨氧化微生物、氨氧化作用和氮的生物地球化學(xué)循環(huán)的知識(shí).在不到10年的研究中，AOA 一直是微生物生態(tài)學(xué)和生物地球化學(xué)循環(huán)研究的熱點(diǎn).然而，對(duì)于AOA 的研究剛處于起步階段，還有很多的未知問(wèn)題亟待科研工作者的潛心研究，例如:1)AOA 的AMO 蛋白結(jié)構(gòu)與氨氧化功能，以及AOA反硝化產(chǎn)生N2O 的作用機(jī)理;2)原位環(huán)境的AOA氨氧化和反硝化作用，以及與AOB 相比對(duì)環(huán)境中氨氧化作用的貢獻(xiàn);3)AOA 的營(yíng)養(yǎng)代謝類型，有機(jī)物對(duì)其生長(zhǎng)的影響;4)AOA 與亞硝酸鹽氧化菌(NOB)之間的生態(tài)關(guān)系;5)來(lái)源于淡水生態(tài)的AOA 菌株的

分離純化，其基因組和功能基因與海洋型AOA 的比較分析.

圖3 N.maritimus 的相關(guān)研究工作Fig.3 Related researches on N.maritimus

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