謝觀蓮,李學(xué)亮,鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州310032)

小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶Hs2st的生理功能和體外應(yīng)用

謝觀蓮,李學(xué)亮,鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州310032)

硫酸乙酰肝素(HS)是由多個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)的二糖單位重復(fù)形成的線型多糖,并以共價(jià)鍵形式與核心蛋白質(zhì)連接形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,而硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(Hs2st)為硫酸乙酰肝素多糖鏈硫酸化修飾的主要硫酸基轉(zhuǎn)移酶,它將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至L-艾杜糖殘基的C2位。研究表明,HS的2-O-硫酸化對(duì)于HS與眾多生長(zhǎng)因子或受體進(jìn)行相互作用是很重要的。缺乏功能性酶Hs2st的胚胎只能存活至出生前,臨產(chǎn)時(shí)會(huì)由于無(wú)法形成完整的腎臟而死亡。這種致命性暗示了HS的2-O-硫酸化在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中有著重要的作用。從形態(tài)學(xué)和分子水平上對(duì)Hs2st在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要性及其在肝素/HS合成過(guò)程中的作用進(jìn)行了綜述。

硫酸乙酰肝素;硫酸乙酰肝素-2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(Hs2st);小鼠;肝素/HS合成

硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate preteoglycans,HSPG)是基底膜(Basement membrane,BM)中普遍存在的重要成分。HSPG能夠結(jié)合BM的層粘連蛋白、Fibulin和Ⅳ性膠原等多種成分,BM以外的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)如纖維連接蛋白等多種成分也能與HSPG結(jié)合。HSPG與細(xì)胞外多功能信號(hào)分子的結(jié)合是通過(guò)變化多樣的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)鏈來(lái)進(jìn)行的[1]。

基底膜糖蛋白與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor,FGF)等細(xì)胞因子及其細(xì)胞膜受體結(jié)合時(shí)修飾和調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的功能分子,不僅參與胚胎器官發(fā)生、血管再生和組織重建,而且在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)過(guò)程中起著重要的作用。研究表明,這些作用不僅與HS的多糖鏈有關(guān),而且與其多糖鏈的修飾程度有關(guān)。參與HS多糖鏈修飾的酶主要有N-脫乙酰/N-硫酸化轉(zhuǎn)移酶(NDST)、C5-異構(gòu)酶和O-硫酸轉(zhuǎn)移酶。在這些酶中,硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(Hs2st)將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至L-艾杜糖殘基的C2位。艾杜糖殘基的C2位是HS的常見成分,在許多天然的HS多糖鏈上均發(fā)現(xiàn)了不同量的已硫酸化的艾杜糖殘基[2-4]。

目前醫(yī)藥級(jí)別的肝素均由動(dòng)物組織中提取得到,雖然利用動(dòng)物組織提取肝素方法簡(jiǎn)單、易操作,但是由于肝素的需求量不斷增加,僅僅通過(guò)動(dòng)物組織提取獲得肝素已經(jīng)無(wú)法滿足需求,此外,2008年的過(guò)硫酸軟骨素污染事件,也讓人們質(zhì)疑從動(dòng)物體提取肝素的安全性。因此,安全生產(chǎn)肝素和硫酸乙酰肝素已成為迫切需要解決的問(wèn)題。

1 Hs2st的酶學(xué)和分子生物學(xué)特性

1.1 Hs2st的克隆表達(dá)

一般RT-PCR擴(kuò)增后,在胚胎及成年小鼠的多種組織中均可檢測(cè)到Hs2st m RNA表達(dá),且表達(dá)水平較高。Wlad等[4]從小鼠肥大細(xì)胞組織中純化得到一種60 k Da的酶,可以同時(shí)催化2-O和6-O硫酸基轉(zhuǎn)移。Kobayashi等[5]和Habuchi等[6]從CHO培養(yǎng)細(xì)胞中分別提取純化得到44 k Da Hs2st和52 k Da Hs6st,與Wlad等獲得的O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶有區(qū)別,說(shuō)明肝素和HS之間的O-硫酸化和N-硫酸化過(guò)程的分子組織是不一樣的。為了明確這些不同之處,Kobayashi等[7]從CHO cDNA文庫(kù)中通過(guò)探針篩選獲得編碼Hs2st的基因序列,其cDNA包含一個(gè)1068 bp的可讀框,編碼一條由356個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈。

Hs2st cDNA(NCBI序列號(hào)D88811)的氨基端包含4個(gè)ATG密碼子。將第一個(gè)ATG所在的序列與真核表達(dá)翻譯后的序列[8]對(duì)比,發(fā)現(xiàn)-3位的堿基是不保守的,而+4位的堿基G則是保守的。Thornberry等[9]研究表明,在缺失-3位堿基的情況下,+4位的堿基G對(duì)于高效翻譯十分重要。其它3個(gè)ATG所在的序列(Met7、Met8、Met24)也與翻譯序列部分一致。這些ATG的-3位置分別是A、A、G,而+4位置不是G,分別是A、C、C。然而第4個(gè)ATG密碼子(Met24)在氨基端的跨膜區(qū),因此不可能成為起始位點(diǎn)。根據(jù)氨基酸序列可知,從CHO細(xì)胞中克隆獲得的Hs2st屬于Ⅱ型跨膜蛋白。在氨基末端,有一段疏水端緊接在一段很短的細(xì)胞溶質(zhì)親水端之后,這段親水端作為未裂解的信號(hào)錨定序列。在疏水端之后是一段可能朝著高爾基體內(nèi)腔的親水端。這些特征與其它的高爾基蛋白類似,如肝素/HS N-脫乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶[10-12]。

Kobayashi等[7]將全長(zhǎng)cDNA與真核表達(dá)載體連接后在COS-7細(xì)胞中表達(dá),Hs2st的活性與對(duì)照組相比提高了2.6倍,且融合蛋白FLAG-Hs2st經(jīng)過(guò)純化后只呈現(xiàn)出Hs2st的活性。Liu等[13]通過(guò)p MAL-c2X與Hs2st全長(zhǎng)cDNA(Arg51～Asn356)連接,導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá),得到的融合蛋白MBPHs2st純化后在SDS-PAGE上檢測(cè)得到75 k Da的條帶,且純化率高于80%。融合蛋白MBP-Hs2st即使不切除MBP標(biāo)簽也能表現(xiàn)出Hs2st的活性且高度可溶。

1.2 Hs2st的活性及底物特異性

Liu等[13]在用酶合成法修飾HS的過(guò)程中,先將O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶固定化,能使其活性更加穩(wěn)定。檢測(cè)O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶的活性需要3′-硫酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)作為硫酸化轉(zhuǎn)移酶的供體。PAPS再生體系最初是由Burkart等[14]研究得到的,應(yīng)用于肝素和硫酸乙酰肝素的酶學(xué)合成。當(dāng)硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體上時(shí),PAPS轉(zhuǎn)變?yōu)?′-磷酸腺苷-5′-磷酸(PAP)。然而, PAP會(huì)抑制HS硫酸轉(zhuǎn)移酶的活性,同時(shí)在毫克級(jí)別合成HS過(guò)程中很難將其去除。PAPS再生體系中,芳香磺基轉(zhuǎn)移酶(AST-Ⅳ)催化硫代對(duì)硝基苯酚(PNPS)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)硝基苯酚(PNP)釋放硫酸基團(tuán),同時(shí)催化PNP轉(zhuǎn)變?yōu)镻APS。因此,HS硫酸基轉(zhuǎn)移酶利用PNPS作為硫酸基供體,而不是PAPS(圖1)[14,15]。Liu等[13]以CDSNS heparin作為底物、[35S] PAPS作為硫酸基供體,通過(guò)比較結(jié)合的35S的量來(lái)檢測(cè)Hs2st的修飾程度。

圖1 PAPS再生體系Fig.1 PAPS Regeneration system

Chen等[16]研究了從小鼠肥大細(xì)胞組織中獲得的Hs2st的底物特異性。他們將不一樣的多糖作為硫酸受體底物檢測(cè)Hs2st的修飾程度,結(jié)果表明,以O(shè)位脫硫酸化的肝素(由[(4)αIdo A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n組成)作為底物時(shí),經(jīng)過(guò)Hs2st修飾獲得2-O-硫酸化的艾杜糖醛酸;而以從E.coli K5中獲得的N位硫酸化的莢膜多糖[(4)βGlc A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n作為底物時(shí),硫酸基僅被轉(zhuǎn)移至葡萄糖醛酸的C2位;此外,如果底物同時(shí)含有艾杜糖酸和葡萄糖醛酸殘基,那么硫酸基更趨于轉(zhuǎn)移至艾杜糖酸殘基的C2位。

2 Hs2st在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用

通過(guò)基因誘捕策略已證實(shí)在編碼Hs2st基因中存在隱性致死插入突變[3,17]。此策略是通過(guò)將載體插入到該基因的開放閱讀框中的內(nèi)含子進(jìn)行的。其中,載體的拼接受體5′端于框內(nèi)融合至lac Z報(bào)告基因中。此外,該載體不僅在內(nèi)源基因的表達(dá)上起作用,而且會(huì)截?cái)鄡?nèi)源轉(zhuǎn)錄,因此是可誘變的。這種突變會(huì)導(dǎo)致Hs2st的失活,進(jìn)而生成完全缺少2-O-硫酸基團(tuán)的HS[18]。

研究者從Hs2st-/-胚胎成纖維細(xì)胞中純化獲得未進(jìn)行2-O-硫酸化的HS,暗示了HS生物合成酶之間的調(diào)控影響。奇怪的是,這種不規(guī)則的HS雖然能與一定的生長(zhǎng)因子結(jié)合,但卻抑制了野生型HSPGs作為共同受體的功能。盡管如此,Hs2st-/-小鼠的表型明確地說(shuō)明了HS的2-O-硫酸化在多數(shù)器官的發(fā)育中的重要性。

2.1 Hs2st對(duì)腎臟發(fā)育的影響

在Hs2st-/-新生小鼠的泌尿生殖器部位,腎臟缺失,僅有盲管狀的尿管存在,但副腎、膀胱和卵巢等其它器官基本正常[19]。后腎是通過(guò)2個(gè)中胚層誘導(dǎo)體——上皮尿管芽(UB)與后腎間質(zhì)(MM)相互作用而形成的。HS可以在腎臟中找到,但卻是以一種最高濃度形式存在于UB和MM間的基底膜中[20,21]。輸尿管芽反復(fù)延伸、分支,最終形成集合管。在純合型變異小鼠胚胎中幾乎未發(fā)現(xiàn)尿管芽分支,也未見明確的間充質(zhì)凝集,提示腎臟發(fā)生停止而不是延遲[22]。可以認(rèn)定,尿管周圍的間充質(zhì)聚合和尿管分支結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中必須有Hs2st基因。尿管芽上皮不表達(dá)Hs2st基因,僅于后腎間充質(zhì)高表達(dá),由此能充分說(shuō)明純合子胚胎腎臟形態(tài)發(fā)生的異常。

2.2 Hs2st對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成的影響

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成和修飾是通過(guò)神經(jīng)管上分泌的信號(hào)分子作用而進(jìn)行的。神經(jīng)管是一種柱狀上皮,最初是單個(gè)的厚層。在發(fā)育早期,神經(jīng)系統(tǒng)就呈向脊髓及背脊髓兩種模式。隨后,內(nèi)表層的神經(jīng)管發(fā)育成神經(jīng)前體,通過(guò)細(xì)胞周期形成不一樣的分化神經(jīng)元,并遷移至神經(jīng)外表層,使得神經(jīng)管不斷加厚并確定了分化神經(jīng)元多個(gè)分層的最終組成。在Hs2st-/-突變體中,盡管Hs2st在底板區(qū)(Floor plate region)和頂板區(qū)(Roof plate region)大量表達(dá)[3],背脊髓的神經(jīng)模式仍然不受影響,向脊髓模式也正常發(fā)生。在大腦皮層和脊髓的加厚過(guò)程中,雖然Hs2st突變體的量有輕微減少現(xiàn)象,但Hs2st突變體卻是可再生的。與此同時(shí),那些表達(dá)Hs2st的組織中的神經(jīng)前體擴(kuò)散量也呈減少趨勢(shì)。

2.3 Hs2st對(duì)骨骼發(fā)育的影響

在大多數(shù)骨骼中,軟骨模型形成最早,于妊娠中后期就開始形成。在每根骨頭的特定形成時(shí)間內(nèi),存在于各自特有成分中央的軟骨細(xì)胞會(huì)退出細(xì)胞周期,且變大,最后被成骨細(xì)胞退化,進(jìn)而形成礦化骨。骨骼中的軟骨內(nèi)部是通過(guò)相同的軟骨不斷增殖而形成的。軟骨存在于長(zhǎng)骨的任意一端。雙向信號(hào)調(diào)節(jié)一系列發(fā)生在軟骨及其周邊的組織(軟骨膜)的活動(dòng),這些活動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞從增殖庫(kù)中移除,并且使得細(xì)胞過(guò)分增大,最后被礦化骨替換[23,24]。軟骨膜和生長(zhǎng)板間的互惠信號(hào)能夠維持母細(xì)胞的增殖和軟骨的特異化間的平衡,以確保骨骼能繼續(xù)生長(zhǎng)。組成大多數(shù)頭蓋骨的骨頭都有著不一樣的形成過(guò)程,稱作膜內(nèi)成骨,在此過(guò)程中,神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞直接特異化為成骨細(xì)胞且不需要軟骨雛形便能產(chǎn)生礦化骨。從Hs2st-/-小鼠中可具體觀察到骨骼石灰化增加、胸骨異位骨化、頸部脊椎骨融合。Hs2st基因在骨骼形成期間的軟骨膜上高度表達(dá),表明這些表達(dá)模式與骨骼的異常發(fā)生密切相關(guān)[25]。

2.4 Hs2st對(duì)小鼠其它組織器官形成的影響

其它一些較小但卻是可再生的缺陷也是很明顯的。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化造成的虹膜雙向缺損現(xiàn)象多見于新生同質(zhì)接合體[21]。在突變體中,不正常的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞于交配后12.5 d時(shí)就已經(jīng)很明顯,Hs2st同質(zhì)接合體中生殖系統(tǒng)的發(fā)育在雄性體中是完全正常的,然而在雌性性分化途徑中卻出現(xiàn)畸形的現(xiàn)象。雌性體內(nèi)臟中的大腸稍微短一點(diǎn),繼發(fā)腭裂也很常見,其在突變體中發(fā)生的概率約為50%,這是因?yàn)楣腔粩_亂,或者是因?yàn)?-O硫酸化的HS在前后軸的延伸中起到的輔助作用[21]。

3 Hs2st在肝素/HS合成過(guò)程中的作用

肝素和HS有共同的合成途徑,研究HS的生物合成機(jī)制為改變HS在細(xì)胞中的合成提供了基礎(chǔ)。不同于蛋白質(zhì)和核酸,多糖的合成是沒有模板的,是在表達(dá)水平上控制其特定的蛋白序列。HS的生物合成在高爾基體中進(jìn)行,然而其核心蛋白質(zhì)的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上進(jìn)行的?？傊?HS的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,包括骨架的延伸和修飾。

3.1 酶學(xué)方法合成肝素/HS的研究

酶學(xué)方法合成HS是基于HS在生物體內(nèi)合成的代謝途徑,利用來(lái)自微生物合成的Heparosan,在各種體外重組的HS生物合成酶的催化作用下合成HS。利用生物合成酶合成的HS具有抗凝血活性。已有報(bào)道利用生物合成酶合成HS,其中含有AT結(jié)合位點(diǎn),雖然產(chǎn)量?jī)H達(dá)到微克級(jí)別,但得率為1.1%,明顯高于化學(xué)合成的0.5%,說(shuō)明此方法是可行的。Lindahl等[22]利用來(lái)自大腸桿菌的莢膜多糖Heparosan,采用化學(xué)方法和酶法合成抗凝血肝素的類似物,已經(jīng)得到AT結(jié)合戊糖、抗凝血?jiǎng)〩S、抗凝血CDSNS肝素、3-O-辛糖。

3.2 Hs2st對(duì)Heparosan進(jìn)行硫酸化修飾

通過(guò)酶學(xué)方法對(duì)Heparosan進(jìn)行多糖硫酸化修飾,從而得到多糖類似物,硫酸化轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行硫酸化修飾時(shí)需要硫酸基供體PAPS。參與Heparosan硫酸化衍生物合成的酶主要有N-脫乙酰/N-硫酸化轉(zhuǎn)移酶(NDST)、2-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶、6-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶、3-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶等。

首先對(duì)Heparosan進(jìn)行N位的脫乙酰及N位的硫酸化,通過(guò)核磁檢測(cè)結(jié)構(gòu)圖比對(duì)N位的處理情況,接著,C5-異構(gòu)酶對(duì)Heparosan骨架進(jìn)行異構(gòu)化,不同的硫酸基轉(zhuǎn)移酶對(duì)相應(yīng)的O位進(jìn)行硫酸化修飾。Heparosan骨架在N-脫乙酰/N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下脫乙?；鶊F(tuán)生成N-硫代葡萄糖胺(Glc NS),同時(shí)將磺酸基轉(zhuǎn)移至N-葡萄糖胺。N-硫酸化骨架生成后,C5-異構(gòu)酶將葡萄糖醛酸(Glc UA)單位異構(gòu)化為艾杜糖醛酸(Ido UA),其后多糖側(cè)鏈分別經(jīng)過(guò)2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、6-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶硫酸化修飾得到HS[14-16],其中Hs2st將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至L-艾杜糖殘基的C2位。

4 結(jié)語(yǔ)

深入研究Hs2st的生物學(xué)功能和體外應(yīng)用可以為探討Hs2st在多種生物中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。此外,通過(guò)研究小鼠體內(nèi)Hs2st引起突變或是其它的HS生物合成酶引起突變的現(xiàn)象能很好地解釋HS在胚胎發(fā)生過(guò)程中的功能模型,且易于進(jìn)行生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及胚胎學(xué)的分析。

從動(dòng)物組織中提取肝素存在安全隱患,且采用傳統(tǒng)化學(xué)方法合成肝素效益低,因此酶學(xué)方法制備肝素受到了人們的廣泛關(guān)注。硫酸化多糖近年來(lái)已用于預(yù)防和臨床治療某些疾病,而它們的治療作用主要與增加其分子量及硫酸化程度相關(guān),Hs2st的研究將為有關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

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Physiological Function and in vitro Application of Mouse Heparan Sulfate 2-O-Sulfotransferase

XIE Guan-lian,LI Xue-liang,ZHONG Wei-hong
(College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032,China)

Heparan sulfate is a linear polysaccharide found in all animal tissues.2-O-sulfation within HS, particularly of iduronate residues,is essential for HS to participate in a variety of high-affinity ligand-binding interactions and signaling processes.Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st)catalyzes the transfer of sulfate to the C2-position of selected hexuronic acid residues within the maturing HS.Previous studies have concluded that 2-O-sulfation of HSis essential for it to cooperate in many growth factor/receptor interactions.Surprisingly therefore,embryos lacking functional Hs2st survive until birth,but die perinatally,suffering complete failure to form kidneys.However,this rather late lethality belies a more intricate involvement of 2-O-sulfated HS during development.The purpose of this review is to summarize the requirements for Hs2st during mouse development at the morphological and molecular level,and its role in the synthesis of heparin and HS.

heparan sulfate;heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st);mouse;synthesis of heparin and HS

Q 781

A

1672-5425(2013)07-0001-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21076195),教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(2011331711004),浙江省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2011C24007)

2013-04-08

謝觀蓮(1987-),女,福建龍巖人,碩士研究生,研究方向:酶學(xué)與基因工程,E-mail:xieguanlian@163.com;通訊作者:鐘衛(wèi)鴻,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。