俞園園

(1.西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室,陜西西安710069; 2.陜西學(xué)前師范學(xué)院化學(xué)與化工系,陜西西安710100)

類人膠原蛋白-銅螯合物的制備及相關(guān)性質(zhì)研究

俞園園1,2

(1.西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室,陜西西安710069; 2.陜西學(xué)前師范學(xué)院化學(xué)與化工系,陜西西安710100)

采用水體系合成法,以類人膠原蛋白為有機(jī)配體制備了類人膠原蛋白-銅螯合物,重點考察了反應(yīng)體系的p H值和質(zhì)量配位比對銅螯合率的影響,并利用紫外可見吸收光譜和傅立葉紅外光譜對銅螯合物進(jìn)行分析檢測。確定優(yōu)化的合成條件為:體系p H值11.0,類人膠原蛋白與硫酸銅的質(zhì)量比10∶1。分析結(jié)果表明:類人膠原蛋白和無機(jī)Cu2+之間存在相互作用,生成的銅螯合物是一種不同于類人膠原蛋白的新化合物;羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均與蛋白質(zhì)-金屬螯合物的形成有關(guān),且該螯合物保持了類人膠原蛋白分子本身的α-螺旋結(jié)構(gòu)。為類人膠原蛋白-銅螯合物的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

類人膠原蛋白;銅;螯合

蛋白質(zhì)在機(jī)體的生長和發(fā)育過程中承擔(dān)著基礎(chǔ)性的生物學(xué)功能,銅是蛋白質(zhì)氧化還原反應(yīng)中重要的催化輔因子。銅也是生物體內(nèi)必需的一種微量元素[1],機(jī)體保持銅元素內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分重要[2]。另外,銅還與哺乳動物體內(nèi)有效的鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)[3]。

傳統(tǒng)的補(bǔ)銅制劑為無機(jī)鹽,但其生物利用率通常較低,近年來,人們對補(bǔ)銅制劑進(jìn)行了大量研究,特別是銅的氨基酸、短肽以及低分子量蛋白質(zhì)螯合物,其中銅螯合物不僅生物利用率較高[4]、對機(jī)體無毒副作用,同時還具有一些重要的藥理學(xué)效應(yīng),包括抗炎、抗菌、抗?jié)儭⒖贵@厥甚至抗腫瘤活性[5]。

類人膠原蛋白(Human-like collagen,HLC)是一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì),與傳統(tǒng)的動物源膠原蛋白相比具有無病毒隱患、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、生物相容性良好、免疫原性低、可加工性高等優(yōu)點[6,7]。在科研人員對氨基酸/多肽-銅螯合物進(jìn)行研究的基礎(chǔ)之上[8,9],作者采用水體系合成法,以類人膠原蛋白為有機(jī)配體制備銅螯合物,考察了體系p H值和質(zhì)量配位比對銅螯合率的影響,并通過紫外可見吸收光譜和傅立葉紅外光譜對類人膠原蛋白-銅(HLC-Cu)螯合物進(jìn)行分析檢測,為HLC-Cu螯合物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

類人膠原蛋白,西安巨子生物基因技術(shù)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

So LAARM6型原子吸收分光光度計,Thermo Scientific;2802pcs型紫外可見分光光度計,Unico;EQUINOX-55型傅立葉紅外光譜儀,Bruker;FE 20型精密p H計,Mettler Toledo;1200型磁力攪拌器,Jenway;FD5-8型真空冷凍干燥機(jī),Sim。

1.2 方法

稱取一定量HLC溶于蒸餾水中,室溫下攪拌20 min使其完全溶解,再向其中加入一定量的CuSO4溶液,用1.0 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)p H值至一定值,反應(yīng)30 min,將反應(yīng)混合液置于透析袋中,每隔4 h換水一次,過夜透析,以除去其中未參與反應(yīng)的游離Cu2+。將透析后的溶液真空冷凍干燥36 h,得到HLC-Cu螯合物,置于密封袋中保藏。

1.3 分析檢測

(1)采用硫化鈉法對HLC-Cu螯合物進(jìn)行定性檢測[10]。

(2)準(zhǔn)確移取HLC-CuSO4混合溶液10 m L于100 m L容量瓶中,定容,搖勻,用原子吸收分光光度計測定銅元素總量。另取透析后的HLC-Cu螯合物溶液10 m L,同法測定螯合態(tài)銅元素的含量。HLC對Cu2+的螯合率(簡稱螯合率)按下式計算:

(3)用雙蒸水將制備的HLC-Cu螯合物配制成濃度為1 mg·m L-1的樣品溶液。室溫下測定樣品溶液的紫外可見吸收光譜。

(4)稱取HLC-Cu螯合物凍干品2 mg,與100 mg固體KBr混合研磨,壓片。室溫干燥條件下測定樣品的FTIR光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 類人膠原蛋白-銅螯合物合成工藝的優(yōu)化

本實驗采用水體系合成法[11,12]制備HLC-Cu螯合物。研究認(rèn)為,水體系中生成金屬螯合物的反應(yīng)本質(zhì)是SN2取代反應(yīng),即游離配體分子的進(jìn)攻螯合與配位水分子的離去是該反應(yīng)過程中的速率決定步驟,一般情況下金屬離子在水體系中的配位反應(yīng)是一個室溫下的快速反應(yīng)過程,時間和溫度對其影響較小。因此,本研究重點考察反應(yīng)體系的p H值和質(zhì)量配位比(即配體分子與CuSO4的質(zhì)量之比,RHLC/Cu)對HLC-Cu螯合物制備的影響。

2.1.1 p H值的選擇

設(shè)定p H值分別為10.0、10.5、11.0、11.5、12.0,探討其對形成HLC-Cu螯合物的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 p H值和質(zhì)量配位比對螯合率的影響Fig.1 The effects of p H value and chelating mass ratio on chelating rate of Cu2+by HLC

由圖1可知,p H值過高或過低均不利于金屬螯合物的生成,當(dāng)p H值為11.0時,螯合率最高。這是因為,p H值較低時,反應(yīng)體系呈酸性,此時體系中存在的H+將會與Cu2+競爭配體(供電子基團(tuán));p H值較高時,反應(yīng)體系呈堿性,此時體系中存在的OH-將與配體爭奪Cu2+(電子受體),導(dǎo)致生成Cu(OH)2。因此,確定適宜的反應(yīng)體系p H值為11.0。

2.1.2 質(zhì)量配位比的選擇

質(zhì)量配位比過小,形成的螯合結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,導(dǎo)致生成的螯合物穩(wěn)定性較差;質(zhì)量配位比過大,則造成HLC不必要的浪費。設(shè)定質(zhì)量配位比RHLC/Cu分別為10∶1、10∶2、10∶3、10∶4和10∶5,探討其對形成HLC-Cu螯合物的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,隨著質(zhì)量配位比的減小即Cu2+濃度的增大,螯合率相應(yīng)提高。由于銅是一種重金屬元素, Cu2+濃度過大會使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀變性,導(dǎo)致其生物活性喪失。鑒于此,對不同質(zhì)量配位比下制備的HLC-Cu螯合物凍干品進(jìn)行復(fù)水實驗,結(jié)果見表1。

表1 類人膠原蛋白-銅螯合物的復(fù)水實驗結(jié)果Tab.1 The result of redissolution of HLC-Cu complexes

由表1可知,只有當(dāng)RHLC/Cu為10∶1時,螯合物凍干品才能復(fù)溶于水。因此,確定適宜的質(zhì)量配位比為10∶1。

2.2 定性檢測(表2)

表2 類人膠原蛋白-銅螯合物的定性檢測結(jié)果Tab.2 The qualitation result of HLC-Cu complex

由表2可知,最終溶液變?yōu)樗{(lán)紫色,說明其中存在游離的HLC。這些游離的蛋白質(zhì)分子是在Na+置換出Cu2+后才出現(xiàn)的,即最終溶液中的HLC分子原來是與Cu2+相結(jié)合的。由此證明制備得到的產(chǎn)物為HLC-Cu螯合物,既不同于以離子狀態(tài)在水中存在的鹽,也與不溶于水的銅鹽沉淀不同,其穩(wěn)定性介于銅鹽沉淀和可溶性銅鹽之間。

2.3 紫外可見吸收光譜分析(圖2)

由圖2可知,HLC的特征吸收峰在220 nm附近,這是由蛋白質(zhì)分子中肽鍵上羰基(C=O)的n→π*躍遷引起的。酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是蛋白質(zhì)分子中敏感的生色團(tuán),分別在283 nm和251 nm處有吸收,其主要來源于Tyr酚基和Phe苯基對光的吸收[13]。HLC在283 nm和251 nm附近均無吸收,與動物膠原蛋白在220～230 nm處有吸收、而在280 nm附近幾乎沒有吸收的結(jié)論一致。

圖2 類人膠原蛋白及其銅螯合物的紫外可見吸收光譜Fig.2 The UV-visible absorption spectra of HLC and HLC-Cu complex

由圖2還可知,與純HLC相比,HLC-Cu螯合物的紫外可見吸收光譜的最大吸收峰的位置發(fā)生紅移,且強(qiáng)度增加。表明,HLC分子和Cu2+之間存在相互作用,且生成的銅螯合物是一種不同于HLC的新化合物。

2.4 傅立葉紅外光譜分析(圖3)

圖3 類人膠原蛋白及其銅螯合物的傅立葉紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of HLC and HLC-Cu complex

對圖3進(jìn)行分析:

(1)酰胺Ⅰ帶主要來源于羰基的伸縮振動(νC=O),同時伴隨N-H的面內(nèi)彎曲振動、CN的伸縮振動以及CCN的變形振動[14,15]。研究表明,酰胺Ⅰ帶與二級結(jié)構(gòu)類型之間具有下列指認(rèn)關(guān)系:β-轉(zhuǎn)角,1660～1700 cm-1;α-螺旋,1645～1659 cm-1;無規(guī)卷曲,1640～1644 cm-1;β-折疊,1620～1640 cm-1[16]。Cu2+與HLC間的相互作用使HLC分子中酰胺Ⅰ帶的位置由1651.41 cm-1移至1658.07 cm-1,表明羰基參與了該螯合物的形成過程,且Cu2+并未對HLC配體的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,所形成的螯合物仍保持HLC配體相同的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

(2)酰胺Ⅱ帶主要代表N-H鍵的彎曲振動[15,17]。與Cu2+作用后,HLC分子中酰胺Ⅱ帶的位置由1549.14 cm-1偏移至1560.96 cm-1,表明HLC中的N-H基團(tuán)與Cu2+發(fā)生了螯合配位作用。

(3)酰胺Ⅲ帶是C-N基團(tuán)伸縮振動和酰胺鍵中N-H基團(tuán)變形振動的聯(lián)合峰,同時包括來自甘氨酸骨架和脯氨酸側(cè)鏈的CH2基團(tuán)的非平面振動[18]。HLC-Cu螯合物的酰胺Ⅲ帶分別出現(xiàn)在1240.76 cm-1和1243.58 cm-1處。有研究表明,IR比例(指酰胺Ⅲ帶所處位置與1455.63 cm-1處的比例)約等于1意味著螺旋結(jié)構(gòu)的存在[19]。HLC及其銅螯合物的IR比例分別為0.852和0.854,表明Cu2+與HLC發(fā)生相互作用時,Cu2+對HLC分子的螺旋結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生顯著影響,這與酰胺Ⅰ帶處的結(jié)論一致。

(4)酰胺A帶主要來自于自由N-H基團(tuán)的伸縮振動(νN-H)[20,21]。νN-H的位置受氫鍵和與Cu2+發(fā)生配位的N原子的影響。配位作用發(fā)生后,亞氨基的N-H伸縮振動頻率較配位前低,同時峰強(qiáng)增大。HLC及其銅螯合物中的酰胺A帶分別出現(xiàn)在3419.84 cm-1和3395.15 cm-1處,證明N-H基團(tuán)與螯合物的形成有關(guān),這與酰胺Ⅱ帶處的結(jié)論一致。

(5)酰胺B帶對應(yīng)于CH2的非對稱伸縮振動[22,23]。HLC及其銅螯合物的酰胺B帶分別位于2931.43 cm-1和2932.61 cm-1處,二者位置極其接近,表明CH2基團(tuán)未參與HLC與Cu2+的螯合過程。

綜上所述,與純HLC分子的FTIR光譜相比, HLC-Cu螯合物在功能基團(tuán)的吸收峰位置和強(qiáng)度方面均有所不同,羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均與該螯合物的形成有關(guān),而且所得到的螯合物依然保持了HLC分子本身的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

(1)采用HLC為有機(jī)配體制備HLC-Cu螯合物,優(yōu)化的合成條件為:體系p H值11.0、HLC與CuSO4的質(zhì)量比10∶1,在此條件下HLC對Cu2+的螯合率達(dá)90%。

(2)分析表明,待測樣品以HLC-Cu螯合物的形式存在;HLC和Cu2+之間存在相互作用,生成的HLC-Cu螯合物是一種不同于純蛋白質(zhì)的新化合物;羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均參與HLC-Cu螯合物的形成過程,且引進(jìn)Cu2+并未破壞HLC分子本身的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

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Study on Preparation and Properties of the Complex of Human-Like Collagen with Copper

YU Yuan-yuan1,2
(1.Shaanxi Key Laboratory of Degradable Biomedical Materials,School of Chemical Engineering, Northwest University,Xi'an 710069,China;2.Department of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Xueqian Normal University,Xi'an 710100,China)

In this paper,the complex of human-like collagen(HLC)with copper is prepared in aqueous solution and is analyzed by UV-vis absorption spectroscopy and FTIR.The effects of p H value and chelating mass ratio on the coordination efficiency are investigated,and the optimum synthetic conditions are as follows:the p H value of 11.0 and the mass ratio of HLC to copper sulfate of 10∶1.Moreover,it can be concluded from UV-vis absorption spectra that there exists interaction between HLC and copper ions,and the complex is a new chemical compound different from pure protein.In the complex of copper,HLC acts as ligand,linking the copper ions via both groups of C=O and N-H,and the complex retains theα-helical structure of HLC.The results provide theoretical evidence for the further study of the complex of HLC with copper.

human-like collagen(HLC);copper;coordination

Q 816

A

1672-5425(2013)07-0029-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.008

陜西省教育廳自然科學(xué)專項項目(2013JK0703),陜西學(xué)前師范學(xué)院科研基金項目(2013KJ082)

2013-05-03

俞園園(1983-),女,浙江紹興人,博士后,講師,研究方向:蛋白質(zhì)化學(xué),E-mail:yuyuanyuan0317@163.com。