汪婧瑜 張業(yè)輝* 張友勝 劉學(xué)銘 程鏡蓉 陳智毅 王旭蘋 黃利華

（1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 廣州 510610

2 廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系 廣州 510405）

烏鱧（Channa argus）是我國主要的淡水經(jīng)濟魚類[1]，廣泛分布于我國各水域，其蛋白質(zhì)含量高于雞肉、牛肉，具有很高的食用價值和經(jīng)濟價值[2]。烏鱧肉質(zhì)鮮美，口感細(xì)嫩，主要以鮮食為主。在烏鱧飼養(yǎng)過程中，部分烏鱧難以長大，影響烏鱧的售價，還造成飼料的浪費。將這部分營養(yǎng)豐富的烏鱧高值化加工利用，顯得尤為重要。

微量元素需求量雖小但與人體健康息息相關(guān)[3]。隨著社會的進(jìn)步，人們越來越注重對營養(yǎng)和健康的追求。然而，食品的精深加工及日常膳食中草酸和植酸等的攝入都會影響微量元素的吸收，導(dǎo)致微量元素缺乏。相較于其它類型的微量元素補充劑，短肽螯合肽能借助短肽的吸收機制及螯合肽穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)提高無機態(tài)微量元素的吸收率，增強其生物利用率。有研究表明[4-6]，微量元素與具有特殊生物活性的短肽螯合后，仍具有抗氧化，抗菌，免疫調(diào)節(jié)，降血脂，降血糖等生物活性。本研究以營養(yǎng)豐富的烏鱧為原料，在之前研究的基礎(chǔ)上，探究不同結(jié)構(gòu)烏鱧短肽螯合肽對抗氧化活性的影響，以期為烏鱧高值化加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈣、鐵、鋅烏鱧螯合肽，實驗室自制；胰蛋白酶（牛胰，250 U/mg），DPPH，鐵氰化鉀，三氯乙酸，鄰苯三酚，VC，氯化高鐵，三氟乙酸等試劑，均為分析純級；混合標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C（12 500 u）、桿菌肽（1 450 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 u）、Gly-Gly-Gly（189 u）均為NT級，中國計量科學(xué)研究院。

高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher公司；FTIR紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Leo-1530vp場發(fā)射電子掃描顯微鏡，德國LEO公司；Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司；JME-2100高分辨透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同螯合肽制備 取一定量烏鱧蛋白[7]，按35 000 U/g的比例加入胰蛋白酶酶解3 h。在90℃條件下鈍酶10 min。稱取一定量烏鱧短肽溶于去離子水中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。再按一定質(zhì)量比加入金屬離子（短肽∶無水氯化鈣為5∶1，短肽∶氯化亞鐵為3∶1，短肽∶硫酸鋅為2∶1），攪拌均勻，調(diào)pH（6.0，6.0，7.0），于不同溫度（40，25，70 ℃）和時間（30，30，60 min）下反應(yīng)，加入 4 倍體積無水乙醇醇沉1 h，10 000 r/min下離心10 min，取沉淀，60℃條件下鼓風(fēng)干燥得到烏鱧短肽螯合肽成品。

1.2.2 烏鱧魚肉蛋白肽分子質(zhì)量分布測定 樣品的處理：用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)品；先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的TCA與短肽溶液等體積混合除去雜蛋白，再用雙倍的流動相與上述溶液混合，0.22 μm濾頭過濾制備1 mL樣品。

色譜條件：色譜柱為TSK gel G2000SWXL（300 mm×7.8 mm），流動相：乙腈、水、三氟乙酸之比為10∶90∶0.1（體積比），流速：0.5 mL/min，檢測波長：UV 220 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.3 螯合率的測定方法 鈣、鋅離子螯合率的測定：采用EDTA滴定法[8]測定；鐵離子螯合率的測定：采用鄰菲羅啉法[9]測定。

1.2.4 螯合肽粒徑分布 將短肽與螯合肽配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，分散3 h后，采用WJL-628激光粒度儀測定其粒徑分布。

1.2.5 螯合肽Zeta電位分析 將短肽和螯合肽配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，總體積15 mL，在Zeta電位分析儀上進(jìn)行自動電位滴定。

1.2.6 螯合肽氨基酸分析 稱取相同量的短肽和3種螯合肽，采用GB/T5009.124-2003法測定。

1.2.7 螯合肽結(jié)構(gòu)光譜分析 紫外光譜掃描測定：取一定量短肽和螯合肽用蒸餾水溶解，測定其在190～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，以蒸餾水為空白對照。

紅外光譜掃描測定：將經(jīng)溴化鉀壓片法處理的短肽及螯合肽，在400～4 000 cm-1下測定其紅外吸收光譜。

1.2.8 螯合肽微觀結(jié)構(gòu)分析 掃描電鏡分析：將短肽與螯合肽粉末樣品均勻地涂在樣盤雙面膠上，噴金鍍膜處理后，利用Leo-1530vp場發(fā)射型電子掃描顯微鏡觀察。

透射電鏡分析：將短肽和螯合肽配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，吸取1 μL樣品滴加到載有碳膜的銅網(wǎng)上，常溫下自然晾干。采用JME-2100高分辨透射電子顯微鏡觀察。

1.2.9 螯合肽抗氧化活性的測定 DPPH清除率測定：參照Chen等[10]的方法。

H2O2清除率測定：參照Oktay等[11]的方法。

超氧陰離子清除率測定：參照胡振珠等[12]的方法。

還原力測定：參照Pan等[13]的方法。

1.3 統(tǒng)計方法

使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA中的Duncan對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，P<0.05為顯著差異。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱧魚肉蛋白肽分子質(zhì)量分布

從圖1可以看出，混合標(biāo)準(zhǔn)品中，細(xì)胞色素C的保留時間為16.079 min，桿菌肽的保留時間為20.117 min，Gly-Gly-Tyr-Arg的保留時間為21.594 min，Gly-Gly-Gly的保留時間為22.919 min。烏鱧魚肉蛋白肽主要由3部分組成，其保留時間分別為20.388，22.803，23.444 min，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較分析，組分1的分子質(zhì)量為628 u，組分2的分子質(zhì)量為171 u，組分3的分子質(zhì)量為124 u，基本以小分子短肽為主。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品及烏鱧蛋白肽的分子質(zhì)量分布圖Fig.1 The molecular weight distribution of mixed standard and protein peptide

2.2 螯合對烏鱧短肽螯合率、粒徑分布和Zeta電位的影響

不同螯合肽的螯合率見表1。螯合鈣、螯合鐵和螯合鋅3種螯合肽的螯合率差異顯著（P<0.05），其中螯合鐵的螯合率最高。3種螯合肽的平均粒徑存在顯著差異（P<0.05），螯合肽平均粒徑與短肽相比都發(fā)生變化，其中螯合鈣與螯合鐵平均粒徑相近，螯合鋅與短肽平均粒徑相近。螯合鈣、螯合鐵和螯合鋅3種螯合肽的Zeta電位存在顯著差異（P<0.05），螯合鐵和螯合鈣的電位絕對值較螯合鋅和短肽高。

表1 不同螯合肽的螯合率、粒徑及Zeta電位Table1 The chelating rate，particle size and zeta potential of different chelating complex

2.3 螯合對烏鱧短肽氨基酸組成的影響

短肽與螯合肽的氨基酸含量發(fā)生變化（表2）。短肽中Glu含量最高為3.35 mg/g，Asp含量次之為2.95 mg/g。而在螯合鈣和螯合鐵中Asp含量最高且顯著增加，其中螯合鈣為7.39 mg/g，螯合鐵為5.28 mg/g，Glu含量也增加；在螯合鋅中Glu含量最高為5.23 mg/g，Asp含量次之為5.23 mg/g，說明呈酸性的氨基酸含量增加。與短肽相比，螯合肽中 Met，Try，Lys，His含量增加，分別占總氨基酸的17.66%，21.00%，19.15%，這與螯合率的趨勢一致。另外，螯合肽中Thr，Glu，Ala等親水性氨基酸含量也增加。

表2 短肽和螯合肽的氨基酸組成Table2 Proportion of amino acids in oligopeptide and chelating complex

2.4 螯合對烏鱧短肽結(jié)構(gòu)的影響

短肽和螯合肽的紫外掃描光譜圖（圖2）中可以發(fā)現(xiàn)，短肽與螯合肽的最大吸收峰的吸收強度和位置不同。短肽的最大吸收峰為273.8 nm，螯合鈣、螯合鐵、螯合鋅的最大吸收峰分別為259.0，332.2，271.8 nm。另外，螯合肽的吸收強度較短肽增強。

短肽與螯合肽的紅外光譜圖（圖3）中發(fā)現(xiàn)，短肽與螯合肽的特征吸收峰強度和位置發(fā)生變化。短肽紅外光譜圖中，特征區(qū)，由于N-H的伸縮振動，-NH2在3 298.16 cm-1處具有吸收峰；指紋區(qū)，C=O的伸縮振動使得C=O在1 653.90 cm-1處具有吸收峰，-COO-的吸收峰在1 549.75 cm-1處；在1 072.38 cm-1處出現(xiàn)由NH3+變角振動引起的吸收峰；在651.92 cm-1處是由N-H的面外變形振動產(chǎn)生的吸收峰。螯合鈣、螯合鐵、螯合鋅的特征吸收峰發(fā)生改變，其中特征區(qū)氨基的吸收峰為3 274.07，3 318.42，3 285.63 cm-1；指紋區(qū) C=O的吸收峰為1 646.19，1 655.83，1 652.91 cm-1，-COO-的吸收峰為1 550.72，1 534.32，1 537.21 cm-1；NH3+變角振動引起的吸收峰為1 074.39，1 068.53，1 062.74 cm-1處；N-H的面外變形振動產(chǎn)生的吸收峰為576.70，603.70，602.73 cm-1。

圖2 紫外掃描光譜圖Fig.2 UV-VIS spectra

2.5 螯合對烏鱧短肽微觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡（圖4）分析發(fā)現(xiàn)短肽表面光滑，有均勻分布的裂痕；螯合肽中表面粗糙，有空隙和空洞存在，像有“晶體”鑲嵌在表層。其中，螯合鐵表面的“晶體”較多，螯合鋅次之，螯合鈣最少，這與螯合率的趨勢一致。透射電鏡（圖5）分析發(fā)現(xiàn)短肽與螯合肽有不同形態(tài)，短肽呈圓球狀，排布均勻；螯合鈣呈絮狀，團(tuán)成一團(tuán)；螯合鐵呈不規(guī)則圓球形，像鐵離子被包裹在里面；螯合鋅呈橢圓形，周圍帶絮狀。

圖3 傅里葉紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum

圖4 短肽與螯合肽掃描電鏡圖Fig.4 SEM of short peptide and chelating complex

圖5 短肽與螯合肽透射電鏡圖Fig.5 TEM of short peptide and chelating complex

2.6 螯合對烏鱧短肽抗氧化性的影響

由圖6發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度升高，樣品對DPPH自由基的清除率逐漸增加。與短肽相比，螯合肽對DPPH自由基有較強的清除能力，且效果都比VC強。另外，螯合鐵對DPPH自由基的清除率變化范圍最廣。由圖7發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度升高，樣品對H2O2清除率逐漸增加。短肽與螯合肽對H2O2自由基有一定的清除力。與VC相比，VC清除H2O2的能力優(yōu)于短肽和螯合肽。另外，VC對H2O2的清除率變化范圍最廣。由圖8發(fā)現(xiàn)，不同樣品的超氧陰離子自由基抑制能力與其濃度呈正相關(guān)，都隨濃度的增加呈上升趨勢。短肽與螯合肽均對超氧陰離子自由基有一定的抑制作用，與短肽相比，螯合肽的抑制作用較強。不同溶度下，螯合鐵的超氧陰離子自由基抑制能力最強。由圖9發(fā)現(xiàn)，不同樣品的還原力與濃度呈正相關(guān)，隨著濃度的增加而上升。短肽和螯合肽都具有還原力，效果都低于VC。

圖6 樣品的DPPH清除率Fig.6 DPPH clearance of the sample

圖8 樣品的超氧陰離子自由基抑制能力Fig.8 SAFR free radical inhibition activities of samples

3 討論

烏鱧短肽與鈣、鐵、鋅分別螯合后，相同條件下其螯合率、粒徑及Zeta電位都存在顯著差異（P<0.05），其中螯合鐵的螯合率最高（84.46%±0.75%），螯合鋅次之（64.85%±1.44%），螯合鈣最低（59.59%±0.14%），可能與不同離子與烏鱧短肽的氨基和羧基等化學(xué)鍵交聯(lián)程度不同有關(guān)。螯合鐵和螯合鈣的粒徑相近，其電位絕對值也接近。有研究表明，Zeta電位與微粒的穩(wěn)定性有關(guān)，其絕對值越高，溶劑體系內(nèi)微粒穩(wěn)定性越好[14]。螯合鐵電位絕對值最高，螯合鐵的穩(wěn)定性好，這可能與螯合肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖7 樣品的H2O2的清除率Fig.7 H2O2clearance of the sample

圖9 樣品還原力的測定Fig.9 Determination of reduction power of samples

短肽中氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和極性的差異會對金屬離子有不同的親和能力，親和能力強的氨基酸更易與金屬離子結(jié)合[15]。螯合肽中Asp和Glu含量增加，這與高菲等[16]的研究結(jié)果相似，說明親水性氨基酸Asp和Glu對微量元素的螯合能力較強。螯合肽中Thr，Gly，Ala等親水性氨基酸含量增加，說明螯合肽具有較好的水溶性，這與霍思聰?shù)萚17]的結(jié)果相似。有研究表明，Met、Try、Lys、His具有抗氧化活性[18]，螯合肽中這些氨基酸含量增加，分別占總氨基酸的17.66%，21.00%，19.15%，說明螯合鐵的抗氧化活性可能比螯合鈣、螯合鋅高。

螯合肽和短肽的紫外最大吸收峰不同，螯合鈣和螯合鋅發(fā)生紫移，這與付文雯[19]和王旭等[20]的結(jié)果相似；螯合鐵發(fā)生紅移，這與陸劍鋒等[21]的結(jié)果相似。紅外光譜圖中發(fā)現(xiàn)，螯合肽中-NH2和C=O的特征吸收峰發(fā)生變化，螯合鈣與螯合鋅在特征區(qū)-NH2吸收峰和指紋區(qū)C=O吸收峰發(fā)生紅移，螯合鐵發(fā)生紫移；螯合鐵和螯合鋅在指紋區(qū)的-COO-吸收峰與NH3+吸收峰發(fā)生紅移，螯合鈣發(fā)生紫移；螯合肽由N-H的面外變形振動產(chǎn)生的吸收峰都發(fā)生紅移。說明不同金屬離子與短肽中氨基和羧基結(jié)合能力不同，其中螯合鐵的變化最大，可能與螯合鐵的螯合率較高有關(guān)。

螯合肽和短肽表面結(jié)構(gòu)明顯不同，通過掃面電鏡觀察發(fā)現(xiàn)金屬離子與短肽之間還存在吸附作用，像有“晶體”鑲嵌在表層[22]，螯合鐵與烏鱧短肽相比，差異顯著，這與螯合鐵的螯合率較高有關(guān)。透射電鏡結(jié)果顯示螯合肽和短肽結(jié)構(gòu)不同，螯合肽與離子的螯合率不同，其結(jié)構(gòu)也有區(qū)別，其中螯合鐵的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

螯合肽和短肽都具有抗氧化活性，且與短肽相比，螯合肽的抗氧化活性較強，并且螯合肽的抗氧化活性與離子-短肽的螯合率成正相關(guān)關(guān)系，即螯合率高的螯合肽其抗氧化活性也高。這可能是因為離子與短肽結(jié)合后形成新的物質(zhì)，改變了具有抗氧活性氨基酸的含量，從而使得螯合肽的抗氧化活性更強。另外，不同的金屬離子本身可能也有抑制自由基形成和清除活性[23]。通過對螯合肽和短肽結(jié)構(gòu)的分析，可以推測螯合肽的結(jié)構(gòu)式，即離子被短肽的NH2和COOH包裹在中央，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)[24]?？寡趸钚缘难芯拷沂玖穗x子與具有特殊生理功能的短肽螯合后，也具有相同的生理功能。

通過研究不同結(jié)構(gòu)烏鱧短肽螯合肽對其抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)螯合肽因其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)提高了無機態(tài)微量元素的吸收率，還能補充具有特殊的生物活性的氨基酸。因此，烏鱧短肽螯合肽作為新型的功能制劑，具有重要的經(jīng)濟和現(xiàn)實意義，對食品、醫(yī)藥以及化妝品行業(yè)具有一定的應(yīng)用價值。