吳永祥 金友貞 權(quán)泰亨 畢淑峰 金泰完*

（1 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 安徽黃山 245041

2 安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 韓國(guó)安東 760-749）

肥胖是一種慢性疾病，同時(shí)也是Ⅱ型糖尿病、血脂異常癥、心血管疾病、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生的主要誘因，正成為本世紀(jì)全球健康最大的危險(xiǎn)因素之一[1]。目前，市場(chǎng)上用于治療肥胖的藥物雖很多，但長(zhǎng)期服用效果不理想，而且存在嚴(yán)重的副作用，比如頭疼、嘔吐、胃疼、腹瀉等，因此人們急需一種安全并高效的治療藥物。研究表明許多中草藥植物提取精華和植物中活性成分可作為膳食補(bǔ)充劑治療肥胖[2-3]。

蕨菜（Pteridium aquilinum（L.）Kuhn var.Latiusculum（Desv）Underw），別名龍爪菜、龍頭菜、如意菜等，屬鳳尾蕨科蕨屬多年生不開(kāi)花草本植物，在我國(guó)分布極為廣泛。蕨菜富含多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分，有“山珍之王”之稱。蕨菜作為藥食兩用植物，有很高的藥用價(jià)值，有清熱解毒、消腫、利水、安神、潤(rùn)腸通便等功效[4]。目前研究證實(shí)蕨菜富含黃酮類、多酚類、多糖、萜類和甾體類等生物活性物質(zhì)[5-8]，具有多種藥理作用，包括抗氧化、抑菌、降血脂、抗炎癥及增強(qiáng)機(jī)體免疫等[9-12]。然而，蕨菜對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J肥胖小鼠是否存在調(diào)控作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究擬通過(guò)建立3T3-L1脂肪細(xì)胞分化模型和高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J肥胖小鼠模型，觀察蕨菜提取物對(duì)脂肪細(xì)胞分化、小鼠體質(zhì)量的抑制作用，評(píng)價(jià)其脂代謝和糖代謝狀況，并從分子上初步闡明其作用機(jī)制，包括對(duì)脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨菜，2016年5月于安徽省黃山市采集，品種經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院方建新老師鑒定。3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，美國(guó)ATCC公司。C57BL/6J小鼠，4周齡健康雄性的C57BL/6J小鼠，Orient Bio，Inc.公司（首爾，韓國(guó)）。

噻唑藍(lán)（MTT）、胰島素、3 異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、油紅 O、TG 測(cè)定試劑盒、TC測(cè)定試劑盒等，美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、小牛血清及其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑，美國(guó)Gibco公司；氧化物酶體增殖劑激活受體（PPARγ）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1c）、α-CCATT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CEBPα）、脂肪合成酶（FAS）、乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC）、β-actin，美國(guó) Cell Signaling Technology 公司；所有的熒光二抗，美國(guó)Jackson Immuno Research公司。

1.2 主要儀器

SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；EV341型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；CP-ST50A型CO2培養(yǎng)箱，長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AllegraX-15R型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；IX51型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蕨菜乙醇提取物的制備 將蕨菜洗凈晾干，60℃烘干至恒重，粉碎成粉末。取蕨菜粉末500.0 g，加入10倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇振蕩提取4 h，抽濾得乙醇提取液，濾渣以同樣方法提取2次。合并3次濾液，減壓濃縮后真空干燥成粉末，得蕨菜乙醇提取物（PAE）96.0 g，計(jì)算得提取效率19.2%。

1.3.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（10%滅活胎牛血清、高糖DMEM、1%青鏈霉素混合液）在37℃、5%CO2且相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，傳代培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[13-14]，采用“雞尾酒法”誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化：細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于24孔板中，待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ（含 0.5 mmol/L IBMX，5 μg/mL 胰島素，1 μmol/L DEX）誘導(dǎo)分化2 d，更換為含誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ（含5 μg/mL胰島素）培養(yǎng)2 d。以后每2 d更換1次基礎(chǔ)培養(yǎng)基，直至90%的前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，并于第8天檢測(cè)脂肪的含量。在細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，加入低、中、高劑量的PAE，同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3.3 細(xì)胞的活性測(cè)定 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)2 d后棄培養(yǎng)基，加入含低、中、高劑量PAE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。參考文獻(xiàn)[15]，采用MTT法測(cè)定各組處理細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)處吸光值A(chǔ)S。按式（1）計(jì)算細(xì)胞活性。

式中，AS——樣品中在570 nm波長(zhǎng)處吸光值；AC——未添加樣品對(duì)照組在570 nm波長(zhǎng)處吸光值。

1.3.4 細(xì)胞脂肪的油紅O染色 參考文獻(xiàn)[16]，在誘導(dǎo)分化的第8天，棄培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次晾干，每孔加入300 μL油紅O染色靜置1 h后棄染液，PBS清洗3次，倒置顯微鏡下拍照。隨后每孔加入200 μL異丙醇，完全溶解細(xì)胞內(nèi)脂滴結(jié)合的油紅O燃料后，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.3.5 高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J肥胖小鼠模型的建立 4周齡健康雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為正常對(duì)照組（ND，n=10）和高脂組（n=20），其中正常對(duì)照組小鼠飼喂普通飼料（根據(jù)美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)AIN-93標(biāo)準(zhǔn)制定），高脂組小鼠飼喂高脂高膽固醇飼料（添加20%豬油，0.5%膽固醇）。飼養(yǎng)6周，將高脂組小鼠體質(zhì)量超過(guò)正常對(duì)照組20%以上作為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠成模的標(biāo)準(zhǔn)[17]，其中體質(zhì)量沒(méi)有達(dá)到顯著性差異的小鼠淘汰。

1.3.6 蕨菜提取物對(duì)肥胖小鼠的干預(yù) 造模成功后，正常對(duì)照組繼續(xù)飼喂普通飼料，將高脂飲食誘導(dǎo)成功的肥胖小鼠分為2組，肥胖模型對(duì)照組（HFD，n=8）和PAE試驗(yàn)組（添加 1%蕨菜乙醇提取物，HFD+PAE，n=8）。持續(xù)飼養(yǎng) 8周，每 1周測(cè)定一次小鼠體質(zhì)量，最后3周從尾靜脈采血來(lái)測(cè)定小鼠血糖值。小鼠喂養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)韓國(guó)食品研究院動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（Korea Food Research Institute Animal Care and Use Committee，KFRIIACUC，#2010-0011）的要求執(zhí)行。

1.3.7 肝臟及脂肪組織H&E染色 取小鼠肝臟組織和附睪部位白色脂肪組織用4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作切片，H&E染色，然后觀察肝臟脂肪變性情況及附睪脂肪細(xì)胞的大小。

1.3.8 血清脂質(zhì)測(cè)定 血液室溫靜置30 min后，7 000 r/min離心獲得血清，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定TC、TG的含量。

1.3.9 葡萄糖耐受測(cè)試 小鼠禁食過(guò)夜12 h，經(jīng)口灌胃葡萄糖（1 g/kg體質(zhì)量），尾靜脈采血，分別測(cè)定空腹及糖負(fù)荷后30、60、90、120 min的血糖。

1.3.10 Western blot檢測(cè)脂肪細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá) 裂解3T3-L1脂肪細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Bio-Rad蛋白試驗(yàn)進(jìn)行蛋白定量。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干式轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 3 h，接著用含有 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC、β-actin的一抗進(jìn)行免疫印跡。用1∶5 000稀釋的相對(duì)應(yīng)二抗孵育1 h，PBST緩沖液洗清，暗房中滴加發(fā)光底物混合物于膜上，用X光曝光、顯影及定影，即可顯示目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAE對(duì)3T3-L1細(xì)胞活性和分化的影響

由表1可知，不同質(zhì)量濃度PAE（0.1，0.2，0.3，0.4 mg/mL）作用3T3-L1前脂肪細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活性分別為100.58%，99.32%，98.63%，99.78%，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。與未分化前脂肪細(xì)胞（Con）比較，分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞（MDI）油紅O染色的OD值明顯升高，是前脂肪細(xì)胞OD值的4.5倍，細(xì)胞內(nèi)脂肪含量明顯增加且具有顯著性差異（表2，P<0.05），表明成功建立了3T3-L1脂肪細(xì)胞分化模型。添加PAE處理后，脂肪含量則明顯下降。與空白對(duì)照組相比，PAE在質(zhì)量濃度0.2，0.3，0.4 mg/mL處理?xiàng)l件下，其脂肪含量分別下降了14.92%，28.50%，43.98%。結(jié)果表明，PAE在0.1～0.4 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)毒性，而具有顯著抑制脂肪細(xì)胞分化的作用，且隨劑量增加而作用增強(qiáng)。

表1 PAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響Table1 Effect of PAE on cell viability of 3T3-L1 preadipocyte

表2 PAE對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的影響Table2 Effect of PAE on adipocyte differentiation of 3T3-L1cells

2.2 PAE對(duì)脂肪細(xì)胞 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC表達(dá)水平影響

Western blot結(jié)果顯示，與未分化的前脂肪細(xì)胞比較，脂肪細(xì)胞 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC表達(dá)水平均大幅度升高（圖1與圖2，P<0.05）。 0.2，0.3，0.4 mg/mL 質(zhì)量濃度組的PAE均能顯著抑制細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ、CEBPα、SREBP-1c的蛋白表達(dá)；各組PPARγ表達(dá)抑制率分別為18.72%，90.83%，99.47%，CEBPα表達(dá)抑制率分別為90.29%，97.96%，97.81%，SREBP-1c表達(dá)抑制率分別為11.35%，37.46%，73.65%（圖1，P<0.05）。同時(shí)PAE降低了脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS、ACC的表達(dá)，隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)（圖2，P<0.05）。

圖1 PAE對(duì)脂肪細(xì)胞PPARγ、CEBPα、SREBP-1c蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of PAE on the protein expression of PPARγ，CEBPα，SREBP-1c in adipocytes

圖2 PAE對(duì)脂肪細(xì)胞FAS、ACC蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of PAE on the protein expression of FAS，ACC in adipocytes

2.3 PAE對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠體質(zhì)量、攝食量和食物利用率的影響

由圖3可知，喂養(yǎng)6周后，HFD組小鼠的體質(zhì)量與ND組相比，增加了20%以上，具有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型建立成功。從第2周開(kāi)始，PAE顯著降低高脂飲食引起的體質(zhì)量增加，這一作用一直持續(xù)到第8周，且第5周后PAE組小鼠的體質(zhì)量無(wú)顯著性增長(zhǎng)。由表3可知，PAE組攝食量與HFD組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明PAE并非通過(guò)抑制小鼠食欲來(lái)降低小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的速率；PAE組小鼠的食物利用率顯著性低于HFD組（P＜0.05），表明PAE是通過(guò)有效降低小鼠的食物利用率，從而起到抑制脂肪積累、抗肥胖的作用。

圖3 PAE對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig.3 Effect of PAE on the body weight changes in mice fed a high fat diet

表3 PAE對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量、攝食量和食物利用率的影響Table3 Effect of PAE on body weight，dietary intake，food utilization rate in obese mice

2.4 PAE對(duì)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞大小和肝細(xì)胞脂肪變性的影響

通過(guò)對(duì)附睪脂肪組織進(jìn)行H&E染色可知（圖4），HFD組脂肪細(xì)胞在形態(tài)上明顯膨大，而PAE組的脂肪細(xì)胞直徑明顯小于HFD組，同一視野條件下脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，表明PAE降低了小鼠脂肪細(xì)胞的積累，抑制了脂肪細(xì)胞的分化，與PAE抑制3T3-L1細(xì)胞脂肪細(xì)胞分化的結(jié)果一致。與ND組相比，HFD組小鼠的肝臟組織中出現(xiàn)了巨大的脂滴空泡，發(fā)生了脂肪變性，而PAE組肝臟組織脂滴空泡明顯減少，說(shuō)明PAE具有抑制小鼠肝細(xì)胞脂肪變性和改善脂肪化肝細(xì)胞的作用（圖5）。

圖4 PAE對(duì)肥胖小鼠附睪脂肪組織中脂肪細(xì)胞大小的影響（100倍）Fig.4 Effect of PAE on the adpocyte size of epididymal adipose tissue in obese mice（x100）

圖5 PAE對(duì)肥胖小鼠肝臟脂肪變性的影響（100倍）Fig.5 Effect of PAE on the fatty degeneration of liver in obese mice（x100）

2.5 PAE對(duì)肥胖小鼠血清中TC和TG的影響

由圖6可知，與ND組比較，長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致HFD組小鼠TG和TC含量均明顯升高（P<0.05）；PAE干預(yù)后，血清中TG含量顯著降低（P<0.05），然而對(duì)TC含量影響不大，說(shuō)明PAE減輕了血清中TG的沉積，一定程度上改善了肥胖小鼠脂代謝異常。

圖6 PAE對(duì)肥胖小鼠血清中TC和TG的影響Fig.6 Effect of PAE on the TC，TG levels of serum in obese mice

2.6 PAE對(duì)肥胖小鼠血糖和葡萄糖耐量的影響

由圖7可知，與ND組比，HFD組血糖指數(shù)明顯升高（P<0.05）。PAE組的血糖水平，低于HFD組，表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），說(shuō)明PAE能夠有效控制小鼠血糖的上升，對(duì)高血糖有一定的治療作用。在灌胃葡萄糖后30 min，血糖濃度達(dá)到峰值，120 min時(shí)血糖水平基本恢復(fù)正常，其中HFD組的血糖濃度明顯高于ND組（P<0.05），表明高脂飲食導(dǎo)致葡萄糖耐量受損。經(jīng)PAE干預(yù)后，各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均較HFD明顯降低（P<0.05），有效改善了肥胖小鼠的糖耐量異常，見(jiàn)圖8。

3 討論

近些年，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變，全球肥胖率呈直線增長(zhǎng)趨勢(shì)，中國(guó)現(xiàn)已成為肥胖超級(jí)大國(guó)。肥胖不僅影響患者的生活質(zhì)量與體型美觀，更重要的是嚴(yán)重危害身體健康。醫(yī)學(xué)研究表明，肥胖的病理過(guò)程包括脂肪細(xì)胞體積的增大、細(xì)胞數(shù)目的增多以及脂肪的積累，而這些主要?dú)w因于脂肪細(xì)胞的分化[18-19]。因此研究脂肪細(xì)胞分化的抑制作用及分子機(jī)制在肥胖代謝性疾病的防治上具有重要意義。

圖7 PAE對(duì)肥胖小鼠血糖水平的影響Fig.7 Effect of PAE on the blood glucose levels in obese mice

本研究通過(guò)建立3T3-L1脂肪細(xì)胞分化模型和高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J肥胖小鼠模型，觀察蕨菜提取物對(duì)脂肪細(xì)胞分化、小鼠體質(zhì)量的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蕨菜提取物可以顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，減少細(xì)胞中脂質(zhì)的沉積。高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量增加，脂肪細(xì)胞增大，肝細(xì)胞脂肪變性等。而給予PAE處理后，肥胖小鼠體質(zhì)量顯著降低，脂肪細(xì)胞增大、肝細(xì)胞脂肪變性均得到有效改善，表明PAE對(duì)肥胖具有治療效果。通過(guò)對(duì)小鼠攝食量和食物利用率結(jié)果的分析，可知PAE并非通過(guò)抑制小鼠食欲來(lái)降低小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的速率，而是降低了小鼠的食物利用率。PAE還可以降低肥胖小鼠血清中TG含量，然而對(duì)TC含量影響不大，說(shuō)明PAE在一定程度上能夠改善肥胖小鼠脂代謝異常。陳乃富等[10]的研究也觀察到了類似的結(jié)果，表明蕨菜黃酮能夠有效改善高血脂大鼠脂代謝紊亂，起到降血脂的作用。同時(shí)PAE能夠控制小鼠血糖上升，修復(fù)葡萄糖耐量異常，對(duì)高脂飲食引起的高血糖有一定的治療作用，從而改善糖代謝紊亂。

為闡明其中的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。PPARγ和CEBPα是脂肪細(xì)胞分化最重要的兩個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[20]。PPARγ和CEBPα能誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)下游脂肪特定基因表達(dá)，包括脂聯(lián)素、抵抗素和載脂蛋E，并能夠調(diào)節(jié)血脂代謝[21-22]。SREBP-1c也被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠在細(xì)胞分化過(guò)程中增加PPARγ的活性[23]。“雞尾酒法”誘導(dǎo)了脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ、CEBPα、SREBP-1c的高表達(dá)，而PAE降低了PPARγ、CEBPα、SREBP-1c活性，從而抑制了脂肪細(xì)胞分化。FAS和ACC在脂質(zhì)合成和分解代謝中發(fā)揮著重要作用[24]。PAE則降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS、ACC的表達(dá)，減少了脂質(zhì)合成。

圖8 PAE對(duì)肥胖小鼠葡萄糖耐量的影響Fig.8 Effect of PAE on the blood glucose tolerance in obese mice

綜上所述，蕨菜乙醇提取物能夠有效抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化，改善肥胖小鼠體質(zhì)量，消除高血脂和高血糖異常，修復(fù)葡萄糖耐量，這一作用可能與其調(diào)控脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和脂質(zhì)合成相關(guān)基因等密切相關(guān)。