熊 科 熊蘇玥 柳佳蕓 高思宇 鄧 蕾 裴鵬鋼

（1 北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048

2 北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

3 北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

4 北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048）

木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源[1]。這些農(nóng)業(yè)廢棄物資源再生利用率極低，大部分被浪費(fèi)。大力開發(fā)利用這些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機(jī)。此農(nóng)業(yè)廢棄物再利用成為近十幾年各國研究的熱點(diǎn)。在眾多應(yīng)用中，以木聚糖制備有較高附加值的功能低聚糖，是富含半纖維素材料的農(nóng)業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑，具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義[2-4]。低聚木糖作為一種益生元，是近幾年引起廣泛關(guān)注并逐步發(fā)展起來的功能性低聚糖。低聚木糖具有降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)，抗齲齒，降血壓，降低血清膽固醇，抑制病原菌和腹瀉潤腸通便等作用，可應(yīng)用于酸奶、焙烤食品、功能性食品等[5]。低聚木糖中的主要有效成分為木二糖與木三糖。而目前酶法生產(chǎn)采用的微生物來源的木聚糖酶水解木聚糖時(shí)，除了菌株本身產(chǎn)酶活力低下外，水解產(chǎn)物中木二糖、木三糖等特異性成分含量大多低于30%，且含大量木糖、阿拉伯糖等單糖和其它非功能性成分，后期需要較復(fù)雜的工藝和高額的成本來進(jìn)行提純，以提高功能低聚木糖純度（60%～70%）[6]。只有極少數(shù)菌株具有底物水解高酶活力，且水解底物時(shí)產(chǎn)物中木二糖、木三糖比例超過50%[7]。酶法制取低聚木糖的過程中提高催化過程中木二糖、木三糖特異功效成分，消除和減少產(chǎn)生木糖，避免低聚木糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎鞘秦酱鉀Q的一關(guān)鍵問題。而木聚糖酶來源主要依靠真菌、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵產(chǎn)生，低聚木糖的工業(yè)生產(chǎn)中采用鏈霉菌屬來源的木聚糖酶已實(shí)現(xiàn)初步的應(yīng)用[8]，具有一定的安全性與應(yīng)用潛力。通過基因工程手段對鏈霉菌屬來源的木聚糖酶蛋白進(jìn)行改造，以提高其水解產(chǎn)物中功能低聚木糖的產(chǎn)量，降低酶法生產(chǎn)成本，減少后期純化過程中的能耗、污水排放等，降低環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)高效利用低值農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)高附加值低聚木糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究以實(shí)驗(yàn)室先前從全國各地300余份土壤樣品中篩選得到的水解產(chǎn)物中木二糖與木糖產(chǎn)量較高的菌株L10608為目標(biāo)菌株，通過高效液相色譜法檢測其木糖：木二糖：木三糖的產(chǎn)物比例約為4∶5∶2。該菌株發(fā)酵液在酶譜中顯示具有兩種分子質(zhì)量的木聚糖酶，在高產(chǎn)木二糖的同時(shí)，木糖的產(chǎn)量也在一定程度上限制了其在低聚木糖生產(chǎn)工業(yè)中應(yīng)用。研究擬先通過巢式PCR[9]獲得L10608中木聚糖酶基因的全長，并對該木聚糖酶基因進(jìn)行序列分析。為進(jìn)一步闡明木聚糖酶結(jié)構(gòu)與水解產(chǎn)物的聯(lián)系，提高酶蛋白的水解產(chǎn)物中功能低聚木糖等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究同時(shí)對獲得的兩段木聚糖酶基因GH-xyn10/11進(jìn)行原核表達(dá)驗(yàn)證其酶活力，構(gòu)建木聚糖酶GH-xyn10/11的原核大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）表達(dá)系統(tǒng)，奠定對該基因后續(xù)進(jìn)行更深層次研究的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株L10608為實(shí)驗(yàn)室所篩選保藏（CGMCC NO.13271），酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，且產(chǎn)物中低聚木糖含量較高，具有潛在的改造應(yīng)用價(jià)值?？寺≥d體pMD18-T、表達(dá)載體pET28-a，日本TaKaRa公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E.coli BL21（DE3），天根生化科技有限公司。真菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，美國OMEGA公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，中國Solarbio公司；瓊脂糖，西班牙Biowest；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。序列測定由華大基因完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀，德國Biometra公司；凝膠成像儀ImageQuant300、MultitempIII恒溫循環(huán)水浴器，美國GE公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；DHZ-DA全溫振蕩器，江蘇太倉培英；Sigma1-14小型臺(tái)式離心機(jī)，美國Sigma公司；HR60-IIA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海STIK公司；DHZ-DA大容量全溫振蕩器，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需加入瓊脂粉20 g/L。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA的提取及編碼基因保守序列擴(kuò)增 將菌株L10608接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，吸取菌液1.5 mL置于2 mL離心管中10 000×g室溫離心5 min，得到菌體。參考OMEGA基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組。取5 μL混合6*loading buffer上樣，進(jìn)行1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳。

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的青霉及曲霉所產(chǎn)GH11/10族木聚糖酶基因序列，在Block Maker網(wǎng)站設(shè)計(jì)簡并引物，引物設(shè)計(jì)采用primer5.0，引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 簡并引物序列Table1 Primers for xyn-core

以所提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得木聚糖酶基因的保守序列；通過基因組步移巢式PCR的方法獲得木聚糖酶基因的側(cè)翼，巢式PCR程序參考文獻(xiàn)[10]。采用兩輪PCR擴(kuò)增，第2輪擴(kuò)增以第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋40倍為模板，將所得保守序列以及側(cè)翼序列運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接得到木聚糖酶基因的全長。引物設(shè)計(jì)采用primer5.0，引物設(shè)計(jì)如表2所示。第1輪PCR擴(kuò)增選用Q5超保真DNA聚合酶，以基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（98℃ 30 s；98℃ 8 s；59℃25 s；72 ℃ 20 s；循環(huán) 30 次；72 ℃ 2 min），擴(kuò)增反應(yīng)體系參照Q5超保真DNA聚合酶說明書標(biāo)準(zhǔn)體系；第2輪將第1輪的PCR產(chǎn)物膠回收作為模板，選用LA taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95℃ 3 min；95℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；循環(huán) 30 次；72 ℃10 min）。

表2 擴(kuò)增木聚糖酶基因xyn A保守序列以及側(cè)翼序列引物設(shè)計(jì)Table2 Primers for xyn A conserved sequence and flanking sequence

1.4.2 木聚糖酶基因cDNA的擴(kuò)增對拼接好的含木聚糖酶基因開放讀碼框（ORF）的一段序列進(jìn)行分析，根據(jù)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，確定ORF的起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TGA，TAA，TAG），即得到木聚糖酶基因xyn-GH10與xyn-GH11。在NCBI網(wǎng)站上對基因序列進(jìn)行BLAST比對，并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物（表3），以擴(kuò)增木聚糖酶基因片段。

表3 擴(kuò)增全長序列帶酶切位點(diǎn)的引物Table3 Amplification full-length sequence primers with enzyme

按照設(shè)計(jì)好的全長引物進(jìn)行常規(guī)PCR得到全長序列，將PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體在16℃保溫3 h進(jìn)行連接，42℃，60 s熱激導(dǎo)入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有 IPTG、X-gal、Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆子，送至北京華大基因研究中心測序確認(rèn)。

1.4.3 木聚糖酶基因序列分析 基因序列分析主要由理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)3個(gè)部分分析組成。理化性質(zhì)包括蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析網(wǎng)站：http：//web.expasy.org/protparam/；蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)分析網(wǎng)站：http：//web.expasy.org/protscale/；跨膜區(qū)域的預(yù)測網(wǎng)站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；結(jié)構(gòu)域的預(yù)測網(wǎng)站：http：//smart.emblheidelberg.de/與 http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中催化位點(diǎn)的預(yù)測網(wǎng)站：http：//prosite.expasy.org/；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析網(wǎng)站：http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站http：//swissmodel.expasy.org/interactive和三級結(jié)構(gòu)的比對http：//www.rcsb.org/pdb/secondary.do?p=v2/secondary/search.jsp#search_sequences。

1.4.4 重組質(zhì)粒pET28a-xyn-GH10/11連接與轉(zhuǎn)化 獲得目的基因xyn-GH10/11后，用NcoRⅠ和XhoⅠ同時(shí)對表達(dá)載體pET28a和帶有酶切位點(diǎn)的xyn-GH10/11進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)3 h。酶切過后通過1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收帶有粘性末端的xyn-GH10/11和線性化pET28a。

用T4DNA連接酶將回收的帶有粘性末端的xyn-GH10/11和線性pET28a按摩爾比1～7，置于反應(yīng)體系中連接，25℃中反應(yīng)1 h，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xyn-GH10/11。

將10 μL連接體系以體積比1∶5的關(guān)系加入到剛?cè)诨腂L21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔地混勻，冰浴30 min，42℃熱擊60 s，隨即靜置于冰上2 min。并將其混合物轉(zhuǎn)移到裝有1 mL預(yù)熱至37℃的SOC培養(yǎng)基中，37℃，175 r/min振蕩1 h使菌體復(fù)蘇。將上述菌液在無菌條件下涂布至LB抗性篩選平板，37℃倒置培養(yǎng)，直至菌落長出。

1.4.5 重組蛋白表達(dá)及酶活力測定 挑取驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子對其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)[11]。（1）菌種活化：將轉(zhuǎn)化子接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：以2%的接種量，將活化菌液轉(zhuǎn)接至100 mL的LB液體培養(yǎng)基（含 40 μg/mL 卡納霉素）中，37℃，180 r/min 培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8之間。（3）誘導(dǎo)產(chǎn)酶：在無菌條件下，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。（4）超聲破壁獲得粗酶液：4℃下，8 000×g離心 5 min，棄上清收集菌體，用0.02 mol/L，pH 5.5醋酸緩沖液重懸菌體。對重懸液超聲破壁，離心后保留上清即獲得粗酶液。木聚糖酶活力的測定參照DNS法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因xynA保守序列以及側(cè)翼序列擴(kuò)增

電泳如圖1a，其中泳道1，2，3為xyn10族核心片段，大小接近200 bp左右的條帶，泳道4，5，6大小為250 bp左右的條帶xyn11族的核心片段，切膠回收，連接T載體pMD18-T進(jìn)行測序，分別得到一段大小為176 bp與239 bp的序列，即為10族和11族的核心序列xyn-Core。

依據(jù)基因組步移巢式PCR的方法對11族片段3’端與5’端以LAD1-4為引物進(jìn)行側(cè)翼序列的擴(kuò)增。經(jīng)二次擴(kuò)增后得到了1 500 bp和2 000 bp大小的兩條亮帶，切膠回收，連T克隆載體測序。分別得到L10608-xyn11的3’端與5’端側(cè)翼序列片段。依照方法1.4.1節(jié)中10族核心片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)第1輪擴(kuò)增后，以LAD1-3為引物擴(kuò)增時(shí)在750 bp左右均出較為單一且特異性較好的條帶，可直接切膠回收連T克隆載體測序得到5’端側(cè)翼序列。同時(shí)以LAD-4為引物時(shí)在750 bp與1 500 bp處均出現(xiàn)較為單一的條帶，為避免側(cè)翼步移長度不足，將1 500 bp處條帶切膠回收連T克隆載體測序得到3’端側(cè)翼序列。

將連接PMD18-T的送出測序后得到的基因序列進(jìn)行對接，特異性設(shè)計(jì)引物是基于核心片段的兩側(cè)所設(shè)計(jì)的，因此得到的側(cè)翼片段與核心有部分重疊，使用DNAMAN對兩個(gè)片段重疊一致部分進(jìn)行拼接，在基因組步移距離足夠的情況下，得到基因的全長。

2.2 木聚糖酶基因序列全長及cDNA序列的獲得

圖1 核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis

拼接核心序列和側(cè)翼序列得到基因全長xyn-GH10/11。經(jīng)NCBI比對可以確定分別得到以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子的木聚糖酶10族與11族基因。得到兩段基因全長為之后進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析及水解產(chǎn)物研究提供了材料。采用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長片段，結(jié)果如圖1b所示，1～4泳道為xyn10族基因在1 500 bp處有明顯的目的基因條帶，5、6泳道為xyn11族基因在700 bp左右處有明顯的目的基因條帶。分別切膠回收連接T載體測序，測序結(jié)果表明未發(fā)生突變?？蓪⑺眠B接木聚糖酶10族與11族基因的PMD18-T質(zhì)粒用于后續(xù)研究?；虻娜蛄薪?jīng)測序后如圖2a、圖2b所示，找到完整的開放閱讀框，10族木聚糖酶基因全長1 462 bp，11族木聚糖酶基因全長729 bp。經(jīng)測序可得xyn-GH10/11序列如圖2所示。

圖2 基因序列全長Fig.2 Full length of gene sequence

2.3 木聚糖酶基因的序列分析

xyn-GH11蛋白序列中包含242氨基酸；預(yù)測氨基酸分子質(zhì)量：24.003 ku；理論pI等電點(diǎn)：8.98；氨基酸組成中最多為Gly（G）有42個(gè)占17.4%；帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)目（Asp+Glu）為13個(gè)；帶正電的氨基酸數(shù)目（Arg+Lys）為17個(gè)；預(yù)測分子式：C1142H1685N323O363S8；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)：25.92，低于閾值40，因此判斷為穩(wěn)定蛋白；圖3a為各個(gè)位點(diǎn)的親疏水系數(shù)，平均親水系數(shù)：-0.5369可判斷為親水蛋白。由xyn-GH10的預(yù)測結(jié)果可知，xyn-GH10蛋白序列包含476個(gè)氨基酸；預(yù)測氨基酸分子質(zhì)量：50.677 ku；理論 pI等電點(diǎn)：6.98；氨基酸組成中Ala（A）有57個(gè)占12.0%最多；帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)目（Asp+Glu）為41個(gè)；帶正電的氨基酸數(shù)目（Arg+Lys）為41個(gè)；預(yù)測分子式：C2188H3399N653O705S17；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)：27.33，低于閾值40，因此判斷為穩(wěn)定蛋白；圖3b為各個(gè)位點(diǎn)的親疏水系數(shù)，平均親水系數(shù)：-0.365可判斷為親水蛋白。

圖3 氨基酸親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic-hydrophobic property analysis of amino acid

如圖4a可見xyn-GH11酶蛋白唯一可能存在的跨膜區(qū)域位22-48處于信號肽部分。信號肽預(yù)測為“MHQDGSQQDRTQNPAPFGGLSRRGFLV GAGTGAAALAAGSGLLLPGTAHA”1-50 位 氨 基酸。而xyn-GH10蛋白很可能不存在任何跨膜蛋白如圖4b。經(jīng)信號肽預(yù)測可知其含有一段1-41位氨基酸“MGIQALPRAAVRQKLRTPLPALAAGVL GLTAALVPPTNADA”的信號肽序列。

圖4 跨膜蛋白預(yù)測分析Fig.4 Analysis of transmembrane protein

蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)分析如圖5a所示，xyn-GH11蛋白質(zhì)序列共含2個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號肽中，有14個(gè)β片層。如圖5b所示，xynGH10蛋白質(zhì)序列共含12個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號肽中，有15個(gè)β片層。

如圖6中NCBI的結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示：氨基酸第61位到第239為Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域，e-value為3.2e-73，小于10-6，證明其結(jié)構(gòu)預(yù)測可靠。無其它有效的結(jié)構(gòu)域。經(jīng)NCBI與Streptomyces sp.JHA19 11家族木聚糖酶（NCBI accession number：WP_055619964）序列相似度為100%，可以確定其為木聚糖酶11家族基因序列。

圖5 酶蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of enzyme protein secondary structure

圖6 xyn-GH11預(yù)測的結(jié)構(gòu)域Fig.6 Structural domain prediction of xyn-GH11

如圖6b所見，該序列分析具有：功能區(qū)域雙精氨酸易位信號（雙精氨酸易位（TAT）途徑提供跨越傳感能量膜輸送折疊的蛋白質(zhì)，該區(qū)域?qū)儆谛盘栯牟糠郑?；以及功能區(qū)域GH11_3糖苷水解酶家族 11（GH11）域：56-241 與圖6a的NCBI預(yù)測接近；預(yù)測催化位點(diǎn)（在圖中為紅點(diǎn)表示）136位谷氨酸為親核體228位谷氨酸為質(zhì)子供體。

如圖7a在NCBI的結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示：氨基酸第46位到第338為Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域，e-value為4.5e-69，小于10-6，證明其結(jié)構(gòu)預(yù)測可靠。366-472為RICIN_B_lectin結(jié)構(gòu)域，預(yù)測該結(jié)構(gòu)域有纖維素酶活性?；蛐蛄信c Streptomyces sp.JHA19 10家族基因木聚糖酶（GenBank accession number：WP_055619031）相似度為100%，可確定其為10家族木聚糖酶基因序列。

如圖7b所見，該序列分析具有：功能區(qū)域GH10_2為40-340位，與NCBI預(yù)測結(jié)果相近；以及功能區(qū)域RicinB-typelectin篦麻毒素結(jié)構(gòu)域在362-476位與圖7a的NCBI同樣預(yù)測接近，同時(shí)其中包含三對二硫鍵 365-384，407-424，448-465；預(yù)測催化位點(diǎn)（在圖中為紅點(diǎn)表示）277位谷氨酸為親核體169位谷氨酸為質(zhì)子供體。

蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)的分析使用建模網(wǎng)站SWISS-MODEL對已知序列建立模型，如表4中所示RMSD<2.0?，在規(guī)定的范圍內(nèi)是可靠的。且從圖8a和圖8b中可以看出重合度較高，xyn-GH11相似度為84.4%，xyn-GH10相似度為72.6%，均高于40%，屬于可信的模板。

圖7 xyn-GH10預(yù)測的結(jié)構(gòu)域Fig.7 Structural domain prediction of xyn-GH10

表4 GH10/11序列建模RMSD預(yù)測Table4 GH10/11 sequence modeling RMSD prediction

圖8 酶蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)的分析（a）xyn-GH11經(jīng)SWISS-MODEL建模與其模板1hix的比對；（b）xyn-GH10經(jīng)SWISS-MODEL建模與其模板1XYF比對（模板不包括RicinB-lectin結(jié)構(gòu)域）Fig.8 Analysis of tertiary structure of enzyme protein（a）xyn-GH11 by SWISS-MODEL modeling and its template 1hix comparison；（b）xyn-GH10 by SWISS-MODEL modeling and its template 1XYF comparison（without RicinB-lectin structure）

2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

采用T4DNA連接酶將經(jīng)過雙酶切的xynAGH10/11和pET28a進(jìn)行連接，并得到重組質(zhì)粒。按方法3.3.2節(jié)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xyn的構(gòu)建，NcoRⅠ和XhoⅠ將外源片段導(dǎo)入pET28a中，并利用Kan抗生素進(jìn)行篩選。

將隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，采用T7與T7ter做為引物時(shí)，會(huì)在目的片段兩端加約150 bp左右的PET28A質(zhì)粒的片段，如圖8a與圖8b中可以看到749 bp的xyn-GH11加上質(zhì)粒的部分在接近1 000 bp的位置出現(xiàn)了明亮的條帶，1 462 bp的xyn-GH10加上質(zhì)粒的部分在接近2 000 bp的位置出現(xiàn)了明亮的條帶，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h后送出菌液測序，均與得到的基因序列一致。

圖9 克隆子驗(yàn)證PCR電泳圖Fig.9 Clone of xyn-GH11 and xyn-GH10 was verified by PCR

2.5 重組蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

按照1.4.5節(jié)中DNS法測定酶活。如表5可見信號肽對表達(dá)酶活影響較大，10族與11族木聚糖酶未剪切信號肽的重組酶酶活均高于剪切信號肽重組酶酶活?？赡苡捎谛盘栯牟糠治挥谀揪厶敲富虻腘端，N端的改變對木聚糖酶酶活有一定影響，李琴等[13]分別對通過N端延伸與定點(diǎn)突變結(jié)合的技術(shù)手段，構(gòu)造了3個(gè)突變體SrxynF，SrxynM與SrxynFM酶活分別上升了 2.1倍，3.2倍和5.3倍，與此同時(shí)，其水解產(chǎn)物中具有益生元作用的低聚木糖含量上升，木糖含量下降。Zheng等[14]研究的N端改造體xyn△NC4在以櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖為底物時(shí)，酶活分別上升了1.78倍，2.23倍和1.4倍。Cheng等[15]對來自Neocallinmastix patriciarum的木聚糖酶切除了N端的11個(gè)氨基酸后，酶活力在55℃與75℃時(shí)的的殘余酶活分別為61.5%與19.5%。

表5 重組蛋白的酶活測定Table5 Determination of enzyme activity of recombinant proteins

3 結(jié)論

隨著低聚木糖在諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，采用木聚糖酶酶解生產(chǎn)低聚木糖的生產(chǎn)方式相較物理化學(xué)等其它方式體現(xiàn)出環(huán)保、高效的優(yōu)勢[16]。然而通過篩選的天然產(chǎn)木聚糖酶菌株來生產(chǎn)低聚木糖的模式存在天然酶產(chǎn)量低，催化效率低，產(chǎn)酶不穩(wěn)定等問題。因此實(shí)現(xiàn)木聚糖酶的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用逐漸成為人們研究的焦點(diǎn)[17]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程改造菌株特性，構(gòu)建工程菌株的方法成為解決這些問題的有效手段[18]。常用的基因工程手段如通過定點(diǎn)突變木聚糖酶序列中的氨基酸，除了影響酶自身的性質(zhì)還會(huì)改變與底物的結(jié)合能力，當(dāng)改變結(jié)合方式時(shí)，水解產(chǎn)物的種類或所占比例會(huì)受影響。

研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的來源于鏈霉菌屬的兩個(gè)不同家族木聚糖酶基因序列，通過巢式PCR方法從克隆出Streptomyces.sp L10608的兩段編碼木聚糖酶基因序列xyn-GH10和xyn-GH11。xyn-GH10蛋白序列包含476個(gè)氨基酸，12個(gè)α螺旋，15個(gè)β片層。預(yù)測氨基酸分子質(zhì)量：50.677 ku；理論等電點(diǎn) pI：6.98；經(jīng)信號肽預(yù)測可知其含有一段1-41位氨基酸 “MGIQALPRAAVRQKL RTPLPALAAGVLGLTAALVPPTNADA”的信 號 肽序列；除催化域結(jié)構(gòu)外，第366-472位為RICINB-lectin結(jié)構(gòu)域，該非催化結(jié)構(gòu)域有纖維素酶活性。277位谷氨酸為親核體169位谷氨酸為質(zhì)子供體。xyn-GH11蛋白序列中包含242氨基酸，共含2個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號肽中，有14個(gè)β片層；預(yù)測氨基酸分子質(zhì)量：24.003 ku；理論等電點(diǎn)pI：8.98；信號肽預(yù)測為“MHQDGSQQDRTQNPAPFG GLSRRGFLVGAGTGAAALAAGSGLLLPGTAHA”的1-50位氨基酸；預(yù)測催化位點(diǎn)為136位谷氨酸為親核體228位谷氨酸為質(zhì)子供體。

研究在對Streptomyces.sp L10608來源的木聚糖酶基因xyn-GH10/11進(jìn)行分子克隆的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)手段分析其酶結(jié)構(gòu)，通過原核表達(dá)的方式得到了具有生物活性的酶蛋白，并對其是否帶信號肽基因序列進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)保留信號肽的重組酶表達(dá)酶活更高，研究為后續(xù)深入研究不同家族的木聚糖酶的水解特性，以及針對基因序列的改造等基因工程研究提供了基礎(chǔ)材料及理論依據(jù)。