韓長(zhǎng)志+劉艷+任雪敏

摘要：褐環(huán)乳牛肝菌作為針葉樹種上重要的外生真菌，為宿主植物提供營(yíng)養(yǎng)元素和水分，在此過(guò)程中，對(duì)于該菌分泌蛋白發(fā)揮的作用機(jī)制尚不清楚。利用SignalP、ProtComp等預(yù)測(cè)程序?qū)汁h(huán)乳牛肝菌中18 303條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分泌蛋白找尋，明確其含有327個(gè)分泌蛋白，同時(shí)，對(duì)上述分泌蛋白的氨基酸大小分布、信號(hào)肽長(zhǎng)度、信號(hào)肽切割位點(diǎn)等進(jìn)行分析，明確該菌分泌蛋白的氨基酸長(zhǎng)度集中于51～450 aa，信號(hào)肽長(zhǎng)度以17～21 aa的序列最為集中，其信號(hào)肽切割位點(diǎn)均屬于A-X-A類型。通過(guò)上述生物信息學(xué)分析方法有效地實(shí)現(xiàn)了褐環(huán)乳牛肝菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)，分泌蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)類型與其他已經(jīng)報(bào)道的致病疫霉、粗糙脈孢霉、禾谷炭疽菌等分泌蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)一致。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析分泌蛋白在該菌為宿主植物提供營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制提供重要的理論支持。

關(guān)鍵詞：褐環(huán)乳牛肝菌；全基因組；分泌蛋白；信號(hào)肽；預(yù)測(cè)程序

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0045-04

E-mail：hanchangzhi2010@163.com。褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus），別稱褐環(huán)黏蓋牛肝菌、黃黏團(tuán)子、土色牛肝菌等。目前，對(duì)該菌的研究主要集中在發(fā)酵生物學(xué)[1]、發(fā)酵條件[2]、培養(yǎng)條件[3]方面，以及其對(duì)樟子松、油松苗的促生作用[4]和與木霉協(xié)同促進(jìn)紅皮云杉苗木抗逆增效作用[5]等方面，此外還有過(guò)量鈉鹽、堿性pH值[6]和平菇汁[7]、接種量[8]對(duì)其生長(zhǎng)影響及pH值對(duì)其三羧酸循環(huán)、草酸分泌及代謝途徑中關(guān)鍵酶活性影響[9-10]等方面。作為針葉樹種的重要外生菌根菌之一，褐環(huán)乳牛肝菌在提高根系對(duì)磷元素和水分的吸收方面發(fā)揮著重要作用[11]，然而，在此過(guò)程中，該菌中分泌蛋白所發(fā)揮的作用機(jī)制尚不清楚。

真菌中分泌蛋白一般具有N-端含有信號(hào)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域、無(wú)糖基磷脂酰肌醇化蛋白（GPI）錨定位點(diǎn)以及沒(méi)有將蛋白輸送至線粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)等4個(gè)基本特征。前人基于上述特征，對(duì)黃孢原毛平革菌[12]、結(jié)核分枝桿菌[13]、釀酒酵母[14]、根癌土壤桿菌[15]、禾谷鐮刀菌[16]、粗糙脈孢菌[17]、稻瘟菌[18]、大麗輪枝菌[19]、致病疫霉[20]、米曲霉[21]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。然而，對(duì)褐環(huán)乳牛肝菌分泌蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，隨著S. luteus UH-Slu-Lm8-n1全基因組序列的釋放[23]，為開(kāi)展該菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持。本研究以S. luteus蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的18303條序列為基礎(chǔ)，利用SignalP、ProtComp等預(yù)測(cè)程序?qū)Ψ置诘鞍走M(jìn)行找尋，以期進(jìn)一步解析分泌蛋白為宿主植物提供營(yíng)養(yǎng)方面的功能研究打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1褐環(huán)乳牛肝菌數(shù)據(jù)來(lái)源

S. luteus的全基因組序列來(lái)源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Suillus）。

1.2分泌蛋白確定方法

參照前期對(duì)禾谷炭疽菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)方法進(jìn)行[22]。具體而言，利用SignalP v3.0[24]獲得N端具有信號(hào)肽的蛋白序列，并利用ProtComp v9.0[25]實(shí)現(xiàn)上述蛋白的定位；再通過(guò)TMHMM v2.0[26]對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用 big-PI Fungal predictor在線分析實(shí)現(xiàn)蛋白脂質(zhì)錨定修飾（glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins，簡(jiǎn)稱GPI）的預(yù)測(cè)[27]；最后，利用TargetP v1.1[28]實(shí)現(xiàn)非胞外分泌蛋白的排除，最終明確S. luteus中的分泌蛋白。

1.3分泌蛋白信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用LipoP v 1.0[29]預(yù)測(cè)S. luteus中分泌蛋白的信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1褐環(huán)乳牛肝菌中分泌蛋白的預(yù)測(cè)

S. luteus中含有18 303個(gè)蛋白質(zhì)序列，其中，氨基酸長(zhǎng)度最小的蛋白為49 aa，最大的為5 054 aa，蛋白多分布在800 aa以下，有16 966個(gè)，比例高達(dá)92.70%，尤以分布在51～100 aa 的蛋白數(shù)量最多，為4 088個(gè)，比例為22.34%。而高于1 000 aa的蛋白，數(shù)量較小，比例為1.93%（圖1）。

首先，對(duì)上述18 303個(gè)蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn) 1 083 個(gè)蛋白具有信號(hào)肽序列；其次，對(duì)上述蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有378個(gè)蛋白分泌至胞外，705個(gè)蛋白質(zhì)并不分泌到胞外，其中299個(gè)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜，151個(gè)蛋白傳輸至線粒體，104個(gè)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，58個(gè)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，30個(gè)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，25個(gè)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中，而轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及過(guò)氧化物酶的蛋白質(zhì)總共有38

個(gè)；再次，對(duì)上述序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)有290個(gè)蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，有88個(gè)蛋白含有不同數(shù)量的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白數(shù)量為77個(gè)，含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白數(shù)量為8個(gè)，含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白數(shù)量為3個(gè)。結(jié)合前期分析結(jié)果，將290個(gè)不含跨膜結(jié)構(gòu)域的推測(cè)蛋白和77個(gè)含有1個(gè)跨膜域的蛋白，合計(jì)367個(gè)蛋白均初步推斷為分泌蛋白，繼而進(jìn)行后續(xù)GPI錨定蛋白的預(yù)測(cè)；接下來(lái)對(duì)上述序列進(jìn)行GPI錨定蛋白預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)23個(gè)蛋白是GPI錨定蛋白，334個(gè)蛋白序列不具有GPI錨定位點(diǎn)，還有10個(gè)序列小于55個(gè)氨基酸殘基未能進(jìn)行分析；最后，利用TargetP對(duì)344個(gè)非GPI錨定的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)327個(gè)蛋白含有胞外定位信號(hào)，14個(gè)蛋白含有線粒體目標(biāo)肽，3個(gè)蛋白含有其他定位信號(hào)。通過(guò)上述分析，最終獲得327個(gè)具有4個(gè)典型特征的分泌蛋白。endprint

2.2褐環(huán)乳牛肝菌分泌蛋白氨基酸長(zhǎng)度及信號(hào)肽特征

通過(guò)對(duì)327個(gè)分泌蛋白進(jìn)行氨基酸大小分析，發(fā)現(xiàn)這些分泌蛋白在51～100 aa的數(shù)量最多，比例最大，為26.30%，其次為101～150 aa的分泌蛋白，比例為16.51%（圖2）。通過(guò)對(duì)不同長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，尤以450 aa以下的分泌蛋白所占比例較高，為80.12%。結(jié)果表明，分泌蛋白多屬于小型蛋白，其所含氨基酸長(zhǎng)度一般較小，這與前期研究得出的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]等病原菌分泌蛋白特征相一致。

對(duì)上述分泌蛋白所含信號(hào)肽進(jìn)行氨基酸長(zhǎng)度分析，發(fā)現(xiàn)含有信號(hào)肽長(zhǎng)度為17～21 aa的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，比例為6391%，其中尤以所含信號(hào)肽長(zhǎng)度為19 aa的蛋白序列居多，比例為16.82%（圖3）。另外，利用LipoP對(duì)上述分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)244個(gè)蛋白序列含有SPⅠ型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，5個(gè)含有SPⅡ型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，比例分別為74.62%、1.53%，說(shuō)明S. luteus中的分泌蛋白大部分是由SPⅠ型信號(hào)肽酶進(jìn)行識(shí)別，從而切除信號(hào)肽的。

此外，通過(guò)對(duì)S. luteus分泌蛋白信號(hào)肽的切割位點(diǎn) -3～+3 位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)位于-3位、-2位、-1位、1位、2位、3位最多的氨基酸分別為A（丙氨酸）、S（絲氨酸）、A、A、P（脯氨酸）、V（纈氨酸）/T（蘇氨酸）（表1）。因此，位于信號(hào)肽切割位點(diǎn)之前的氨基酸組成為ASA，屬于AXA類型，為SPⅠ型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，與通過(guò)LipoP預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致，同時(shí)，也與前人通過(guò)對(duì)粗糙脈孢菌[17]、馬鈴薯晚疫病菌[20]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白具有的信號(hào)肽的酶切位點(diǎn)類型報(bào)道一致。上述結(jié)果表明，無(wú)論是植物病原菌，還是植物共生菌，對(duì)于分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽序列識(shí)別、切割的信號(hào)肽酶類型多為Ⅰ型。

3討論與結(jié)論

隨著S. luteus全基因組序列的公布，為深入解析其基因功能的研究提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。云南松（Pinus yunnanensis）是我國(guó)西南地區(qū)尤其是云南省境內(nèi)重要的建群樹種，也是該地區(qū)的荒山綠化造林先鋒樹種，其面積、蓄積量分別占云南省林地面積、蓄積量的29.2%、15.8%[31-34]。作為該樹種上重要的外生菌根菌，S. luteus在營(yíng)養(yǎng)元素利用和水分吸收方面發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，宿主植物中約20%的凈初級(jí)生產(chǎn)力將傳遞給外生菌根[35]，其生物量在溫帶森林中約占土壤微生物總生物量的30%[36]。

植物與病原菌互作過(guò)程中，病原菌為了實(shí)現(xiàn)在植物中定殖、擴(kuò)展等過(guò)程，利用分泌蛋白實(shí)現(xiàn)其致病、生長(zhǎng)等生理過(guò)程。然而，對(duì)于外生菌根菌分泌蛋白在營(yíng)養(yǎng)元素利用和水分吸收方面所具有的功能，尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)S. luteus中存在327個(gè)具有典型特征的分泌蛋白，與前期獲得的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]的分泌蛋白數(shù)量相比，明顯較少，是否是由于該菌不是致病菌，致使其所具有的參與植物體內(nèi)定殖、擴(kuò)展相關(guān)的分泌蛋白退化所造成的，有待于今后進(jìn)一步得以明確。就S. luteus分泌蛋白所具有的氨基酸長(zhǎng)度而言，多集中于 51～450 aa之間，比例為80.12%；就分泌蛋白所具有的信號(hào)肽長(zhǎng)度而言，多集中于15～28 aa之間，比例高達(dá)94.19%，上述特征與致病菌分泌蛋白所具有的特征相似。

本研究基于S. luteus蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的18 303條序列，利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP等預(yù)測(cè)程序總共獲得327個(gè)分泌蛋白，明確該數(shù)量明顯低于致病菌的分泌蛋白數(shù)量，同時(shí)，通過(guò)對(duì)上述分泌蛋白進(jìn)行氨基酸長(zhǎng)度、信號(hào)肽長(zhǎng)度以及信號(hào)肽酶切位點(diǎn)等方面的研究，發(fā)現(xiàn)上述分泌蛋白屬于小型蛋白，其信號(hào)肽長(zhǎng)度多集中于17～21 aa，同時(shí)發(fā)現(xiàn)真菌信號(hào)肽的酶切位點(diǎn)類型具有保守性特點(diǎn)。本研究為深入開(kāi)展S. luteus中的分泌蛋白功能研究打下了一定的理論基礎(chǔ)。

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