張志超，黃 勇，徐可成，宋 紅，楊俊譽，張 彧，黃 瓊，3，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 教育部生物多樣性與病蟲害控制重點實驗室，云南 昆明 650201； 2.云南省醫(yī)療器械檢驗所，云南 昆明 650034； 3.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

運用計算機軟件預測木質(zhì)部寄生屬信號肽

張志超1，黃 勇2，徐可成1，宋 紅1，楊俊譽1，張 彧1，黃 瓊1，3，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 教育部生物多樣性與病蟲害控制重點實驗室，云南 昆明 650201； 2.云南省醫(yī)療器械檢驗所，云南 昆明 650034； 3.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

利用已經(jīng)公布的木質(zhì)部寄生屬(Xylellafastidiosa)2 766個基因組數(shù)據(jù)信息，運用在線計算機預測軟件，分析了木質(zhì)部寄生屬(Xylellafastidiosa)的分泌蛋白組。運用SignalP version 2.0 預測得到204個開放閱讀框架具有編碼蛋白質(zhì)的N-端信號肽；運用TMHMM、GPI-anchored預測具有非跨膜蛋白(或者在N-端信號肽只有1個跨膜區(qū))，不具有錨定位點的173個，運用TargetP預測除去分泌到線粒體以及位置不確定的分泌蛋白，最終得到X.fastidiosa的分泌蛋白為149個。分泌類信號肽(Sec-type)114個和具雙精氨酸結(jié)構(gòu)的信號肽(RR-motif)32個，分別占分泌蛋白的76.5%和21.5%，脂蛋白信號肽3個，僅占2%，沒有預測到類前菌毛信號肽和細菌素及外激素信號肽。

木質(zhì)部寄生屬；分泌蛋白；信號肽

木質(zhì)部寄生屬(Xylella)菌體短桿狀，單生，大小為(0.25～0.35)μm ×(0.90～3.50)μm，細胞壁波紋狀，無鞭毛，不能運動。革蘭氏染色反應陰性，好氣性，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性。對營養(yǎng)要求十分苛刻，要求有生長因子。營養(yǎng)瓊脂上菌落有兩種類型：一種是枕狀凸起，半透明，邊緣整齊；另一種是臍狀，表面粗糙，邊緣波紋狀。DNA中G+C含量為 49.5%～53.1%。

寄生木質(zhì)部的類立克次體(rickettsia-like organism，RLO)或木質(zhì)部難養(yǎng)菌 (xylem limited bacterium，XLB)可引起葡萄皮爾氏病(PD)，也易導致梅、榆樹、槭樹、櫪屬、懸鈴木、桑樹、咖啡、苜蓿、柑橘、桃等感染病害[1-2]，近年來該菌已獲得純培養(yǎng)并接種成功，鑒定為木質(zhì)部寄生屬(X.fastidiosa)。該菌由葉蟬類昆蟲傳播，侵染木質(zhì)部后在導管中生存、蔓延，使全株表現(xiàn)葉片邊緣焦枯、葉灼、早落、枯死，生長緩慢、生長勢弱、結(jié)果減少和變小、植株萎蔫等癥狀，最終導致全株死亡。侵染這些植物的X.fastidiosa都屬于同一個種，但在寄主范圍和致病性上有差異，RFLPs、DNA (RAPD)-PCR、RFLP和DNA-DNA雜交研究顯示，PD菌株與侵染桃、梅以及小長春花三種植物的菌株有明顯差異[3]。用RAPD-PCR及16S-23S rDNA分析可將X.fastidiosa分為葡萄、桑樹、榆樹、懸鈴木、柑橘5個親緣關系相近的遺傳類群[4-5]。在原有研究基礎上，本文利用已公布的葡萄皮爾氏病的全基因組序列分析預測信號肽的比例和類型[6]，運用在線計算機預測軟件，分析木質(zhì)部寄生屬X.fastidiosa的分泌蛋白組。

1 材料與方法

木質(zhì)部寄生屬2 766個基因序列來源于Superfamily(http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/gen_list.cgi？genome=xf)。我們將N-端信號肽，無跨膜區(qū)，無GPI-錨定位點，位于線粒體或其他細胞器的蛋白質(zhì)無分泌信號的歸為水溶性分泌蛋白，滿足以上條件者作為計算機預測的分泌蛋白。

我們應用Internet上SignalPv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)確定N-端信號肽，TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM)預測跨膜區(qū)，TargetP v1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) 預測GPI-錨定位點。

2 結(jié)果與分析

木質(zhì)部寄生屬的2 766個基因，蛋白長度范圍為30～3 455個氨基酸。采用SignalP 2.0對2 766個蛋白序列進行信號肽預測，用SignalP的Smean和Cmax判定能分泌的蛋白質(zhì)的有效性[7]。用SignalP確定N-端信號肽204個，Smean和Cmax均大于0.5；TMHMM分析整個基因組發(fā)現(xiàn)，2 207個蛋白序列無跨膜區(qū)，356個蛋白序列有1個跨膜區(qū)，83個蛋白序列有2個跨膜區(qū)，120個蛋白序列有2個以上的跨膜區(qū)。TargetP分析結(jié)果表明，S型分泌途徑為640個，486個分泌到線粒體，1 640個分泌位置不確定。對SignalP確定的204個N-端信號肽分析發(fā)現(xiàn)，其中31個信號肽具有2個和2個以上的跨膜區(qū)，105個信號肽沒有跨膜區(qū)，68個信號肽具有1個跨膜區(qū)，且跨膜區(qū)位于N-端55個氨基酸的前40個氨基酸的位置，因此，173個信號肽具有潛在的分泌蛋白。由于原核生物細胞通常分泌蛋白進入細胞器，較少分泌到胞外，采用TargetP分析這173個分泌蛋白，除去分泌到線粒體的13個分泌蛋白和分泌位置不確定的6個分泌蛋白，S型分泌途徑為154個。對154個S型分泌途徑的蛋白進行GPI-錨定位點分析，發(fā)現(xiàn)沒有一個具有GPI-錨定位點，因此保留沒有GPI-錨定位點的154個分泌蛋白，并對其中5個無法歸類的可疑分泌蛋白，進行PSORT II Prediction(http://psort.nibb.ac.jp/form2.htmlPSORT II Prediction (experimental)Lastupdate:November24， 1999)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不具有N-端信號肽，最終預測到149個N-端信號肽。占全基因組總量的6%。預測信號肽的步驟如圖1。

2.1 信號肽長度及氨基酸組成

對149個分泌蛋白的信號肽長度及組成信號肽的氨基酸種類進行比較，結(jié)果見圖2和圖3。信號肽長度分布范圍為18～50個氨基酸，主要集中分布于長度為19～26個氨基酸，約占全部信號肽的66%。其中，信號肽長度出現(xiàn)頻率最高的為20、22、23、24和26個氨基酸，均為9%。

圖1 木質(zhì)部寄生屬信號肽預測分析流程Fig.1 Flowchart of strategy used to predict X. fastidiosa

組成信號肽的氨基酸種類統(tǒng)計分析表明，組成信號肽的氨基酸中非極性氨基酸占45%，極性氨基酸占15%，酸性氨基酸占31%，堿性氨基酸占8%，最多的4種氨基酸依次為亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、纈氨酸(T)和絲氨酸(S)，分別占氨基酸總量的19%、14%、 8%和8%。而天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)的含量極少，組成信號肽的氨基酸總量為3 752個，而天冬氨酸、谷氨酸則分別為11和12個。

2.2 信號肽的種類

依據(jù)信號肽酶的識別序列，氨基末端信號肽分為4種類型：第一類為分泌型信號肽(I型)，包括分泌類信號肽(Sec-type)和雙精氨酸-基序(RR-motif)信號肽。分泌類信號肽(Sec-type)：N-區(qū)平均含有1～2個正電荷的賴氨酸(K)或精氨酸(R)，H-domain由平均19aa構(gòu)成，C-區(qū)含有SPasesⅠ酶剪切位點，即從-3位到-1位，一般序列為A-X-A，其中X代表任意氨基酸，具有Sec-信號肽的分泌蛋白；雙精氨酸-基序(RR-motif)信號肽：信號肽中含有RR×##(##指疏水氨基酸)的保守序列，通過Tat途徑運送。第二類為脂蛋白信號肽(Ⅱ型)：通常比分泌型信號肽短，切割位點后一個氨基酸為C，這樣就形成保守的L-(A/S)-(A/G)-C的lipobox。第三類是由類似前菌毛蛋白(Prepilin-like)(Ⅳ型)的信號肽組成，能被前菌毛蛋白?；男盘栯拿窩omC剪切。第四類信號肽是在核糖體合成細菌素和外激素中發(fā)現(xiàn)，合成的細菌素和外激素是通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白運送[8]，這類信號肽缺乏疏水的H-區(qū)。

圖2 木質(zhì)部寄生屬信號肽的長度與分布Fig.2 Length distribution of predicted signal peptide in X. fastidiosa

圖3 木質(zhì)部寄生屬信號肽的氨基酸的組成Fig.3 Frequencies of amino acid in signal peptide of X. fastidiosa

根據(jù)信號肽的分類方法，對149個分泌蛋白的信號肽進行了分類。其中146個分泌蛋白信號肽的N-區(qū)平均含有1～2個正電荷的賴氨酸(K)或精氨酸(R)，其中含一個正電荷氨基酸K或R的分泌蛋白信號肽為114個，占76.5%，具雙精氨酸結(jié)構(gòu)的信號肽為32個，占21.5%。因此，分泌型信號肽的比例很大，約98%的信號肽為分泌型信號肽，其余3個為脂蛋白信號肽，僅為2%。沒有發(fā)現(xiàn)Prepilin-like信號肽和細菌素和外激素信號肽。根據(jù)Xylellafastidiosa9a5c 基因注釋，預測的149個信號肽中超過50%的功能未知，表1僅列出功能已知的信號肽。

表1 木質(zhì)部寄生屬基因組中預測的功能已知的信號肽

Table 1 List of predictedXylellafastidiosasignal peptides of known function

名稱Name蛋白長度LengthofProtein切割位點PositionofCleavageS值SmeanC最大值Cmax跨膜區(qū)TM分泌途徑TP描述Descriptiongi_15838025262200.9480.9950SChitinasegi_15837586603210.6370.8390SGamma-glutamyltranspeptidasegi_15837442612230.710.9991SBeta-galactosidasegi_15838324362230.8180.9550SSugar-phosphatedehydrogenasegi_15836620795240.94710SDipeptidyl-peptidasegi_15837178700250.9060.5270SMetallopeptidasegi_15837447882270.7550.5560SFamily3glycosidehydrolasegi_15837055287270.530.6621SIntegralmembraneproteinasegi_15838421727270.8850.9670STail-specificproteasegi_158384491000270.9580.6591SSerineproteasegi_15837383597240.8960.9590SLipase/esterasegi_15837151702260.7080.6780SMethionyl-tRNAsynthetasegi_15837246230200.81510SPeptidyl-prolylcis-transisomerasegi_15837440464260.7470.9381SPeptidyl-prolylcis-transisomerasegi_15837420592260.9060.9020SEndo-1,4-beta-glucanasegi_15837689652260.8570.9680SCardiolipinsynthasegi_15838205194280.9020.9851SABCtransportervitaminB12uptakepermeasegi_15838222455290.7110.7920SBeta-lactamasegi_15839297356340.8640.9970SEndo-1,4-beta-glucanasegi_15839266721300.6350.9981SL-ascorbateoxidasegi_15838432154190.9110.9110SDisulphideisomerasegi_15838341405310.8820.9991SGlucosedehydrogenaseBgi_15838342294310.7040.9910SDaunorubicinC-13ketoreductasegi_15838775374320.8280.7780SMembrane-boundlytictransglycosylasegi_15837259576390.9060.731SAlkalinephosphatasegi_15837509297220.92911SSolublelyticmureintransglycosylaseprecursorgi_15837018351230.9290.5780SLipoproteinprecursorgi_15836688184260.96711SFimbrialsubunitprecursorgi_15837448891280.9440.9691SBeta-mannosidaseprecursorgi_15836687266310.6960.9981SChaperoneproteinprecursorgi_15837361539350.5480.9980SN-acetylmuramoyl-L-alanineamidaseprecursorgi_15838519242260.8180.9821SSuperoxidedismutase[MN]precursor

續(xù)表1

gi_15837826為Sec-type信號肽；gi_15837259為RR-motif信號肽；gi_15838494為脂蛋白信號肽。

gi_15837826 was Sec-type signal peptide. gi_15837259 was RR-motif signal peptide. gi_15838494 was lipoprotein signal peptide.

3 討論

如上所述，木質(zhì)部寄生屬是一類重要的植物病原菌，其基因組序列的完成對更深入地研究其生物學特性和致病特性無疑將起到巨大的推動作用。對于革蘭氏陰性細菌的大量研究表明，分泌蛋白是病原細菌重要的致病因子。盡管目前的研究結(jié)果中，革蘭氏陰性細菌的致病因子主要是由三型分泌途徑進行分泌的。對于木質(zhì)部寄生屬來說，還沒有發(fā)現(xiàn)其中有三型分泌途徑(Type III secretory system)的報道，目前對于通過信號肽識別機制分泌的蛋白在致病和其他生長過程中的作用也還未知。勿庸置疑的是，這些分泌蛋白在基因組中大量存在，表明其發(fā)揮作用的主要場所是在細胞外的，是該細菌與環(huán)境，包括與寄主互作的重要蛋白。因此，對于這類蛋白的研究，有助于全面了解病原菌的生物學特性和致病特性。在對這些蛋白進行試驗之前，首先通過生物信息學方法對其特性進行分析，將有助于設計試驗思路和提高研究效率。本研究采用Internet信號肽分析軟件SignalPv2.0 v、TargetP 1.0 v、big-PI predictor 和TMHMM v2.0預測木質(zhì)部寄生屬基因組中含有信號肽的分泌蛋白、分析分泌蛋白的運送途徑及信號肽類型。預測結(jié)果表明，基因組中共存在149個分泌蛋白，占全基因組總基因數(shù)量的6%，與革蘭氏陽性細菌Bacillussubtilis， 革蘭氏陰性細菌Sulfolobussolfataricus分泌蛋白相比(表2)，Sec-type分泌蛋白最多，為Sac分泌途徑。Xylellafastidiosa與Sulfolobussolfataricus均為革蘭氏陰性細菌，均未預測到Prepilin-like信號肽以及細菌素和外激素信號肽；而枯草芽孢桿菌有4種信號肽，4種分泌途徑都有[8]，這可能是革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌分泌蛋白的差異。但Xylellafastidiosa中有脂蛋白信號肽，Sulfolobussolfataricus則缺乏該類信號肽。所預測的信號肽中功能未知的有79個，占信號肽的53%。因此，快速預測基因組的信號肽，對蛋白質(zhì)功能研究具有一定參考價值。從基因注釋可知，預測具有分泌類信號肽的gi_15837945、gi_15838205具有ABC transporter的功能，可能屬于細菌素和外激素信號肽。預測的與實際的信號肽會有一定的偏差，有待實驗的驗證。

表2 細菌中不同類型信號肽出現(xiàn)頻率的比較

Table 2 Frequency of different types of signal peptides in bacteria

名稱Name分泌類Sec-type雙精氨酸RR-motif脂蛋白Lipoprotein類前菌毛Prepilin-like細菌素和外激素Bacteriocin&Peromone百分率Percentage/%Bacillussubtilis18027114437.0Sulfolobussolfataricus11430004.2Xylellafastidiosa114323005.4

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(責任編輯 張 韻)

Prediction of signal peptide ofXylellafastidiosabased on internet softwareZHANG Zhichao1， HUANG Yong2， XU Kecheng1， SONG Hong1， YANG Junyu1， ZHANG Yu1， HUANG Qiong1，3，*

(1.KeyLaboratoryofBio-diversityforPlantDiseasesManagementofMinistryofEducation，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China; 2.YunnanInstituteofMedicalEquipment，Kunming650034，China; 3.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofBio-ResourcesinYunnan，Kunming650201，China)

One approach to rapidly predict the functions of an entire proteome is to utilize genomic database information and prediction software. Thus， we used a set of prediction algorithms to computationally define a potential secretome. InXylellafastidiosa， the N-terminal signal peptide was predicted by SignalP version 2.0. Two hundred and four ORFs were predicted to encode proteins with N-terminal signal peptides. Among these， 173 were predicted with no transmembrane domain (or a single transmembrane domain at the extreme N-terminus). TargetP was used to eliminate proteins with 19 mitochondrial targeting signals， and 154 was predicted not to be GPI-anchored. The final computationally-predictedXylellafastidiosasecretome was estimated to consist of up to 149 ORFs. One hundred and fourteen secretary signal peptides and 32 twin-arginine signal peptides which occupied 76.5% and 21.5% of secretome respectively， and 3 lipoprotein signal peptides only occupied 2%， preplan-like， bacteriocin and pheromone signal peptides were not found.

Xylellafastidiosa; secreted protein; signal peptide

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.23

2016-06-21

國家自然科學基金項目(31270067)

張志超(1992—)，男，遼寧丹東人，碩士研究生，主要從事植物病理學研究。E-mail: zhangzc927@163.com

*通信作者，黃瓊，E-mail: huangqiong88hs@163.com

S432.4

A

1004-1524(2017)03-0515-06

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 515-520

http://www.zjnyxb.cn

張志超，黃勇，徐可成，等. 運用計算機軟件預測木質(zhì)部寄生屬信號肽[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(3)： 515-520.