盧金達，廖乾生，杜志游

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310018)

突變和重組可克服異源復(fù)制酶在病毒復(fù)制中的功能缺陷

盧金達，廖乾生，杜志游*

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310018)

異源復(fù)制酶的組合無法有效地支持重組病毒的復(fù)制是雀麥花葉病毒科病毒存在的普遍現(xiàn)象。利用雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬的典型成員黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus，CMV)和番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，TAV)作為研究對象，分析2個復(fù)制酶的異源組合對重組病毒復(fù)制的影響。通過農(nóng)桿菌浸潤，將CMV RNA1(C1)和TAV RNA2(T2)進行異源組合，并將此與CMV RNA3(C3)或TAV RNA3(T3)混合侵染本生煙。接種后10 d，C1T2C3和C1T2T3接種的植物沒有出現(xiàn)明顯的病毒癥狀，通過Northern雜交，在系統(tǒng)葉中僅檢測到微弱的病毒特異條帶，這說明C1T2的異源組合無法高效地支持病毒的復(fù)制和侵染。當(dāng)C1T2C3轉(zhuǎn)接3代之后，接種的本氏煙植株表現(xiàn)明顯的病毒癥狀，且病毒RNA的積累水平顯著增加。病毒基因組RNA的測序結(jié)果顯示，C1第1 390位、T2第1 695位發(fā)生點突變，而且C3的3′末端融合了T2的完整3′ UTR序列。以上結(jié)果表明，通過病毒的突變或/和重組可有效提高異源復(fù)制酶對重組病毒的復(fù)制效率。

黃瓜花葉病毒；番茄不孕病毒；復(fù)制酶；突變；重組

病毒基因組的突變、重組和重排是病毒自然進化的內(nèi)在動力。自然界中，雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)同屬病毒種間的基因組重組和重排事件發(fā)生比較普遍，但主要發(fā)生在編碼移動蛋白和外殼蛋白的基因組RNA3，而非編碼復(fù)制酶組分的基因組RNA1和RNA2[1-2]。雀麥花葉病毒科同屬病毒種間的復(fù)制酶具有不兼容性，從而導(dǎo)致復(fù)制酶的異源組合不能有效地合成病毒基因組或亞基因組RNA[3]。黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，TAV)同屬于雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員[1]。黃瓜花葉病毒屬病毒基因組由3條正義單鏈RNA構(gòu)成：RNA1編碼復(fù)制酶1a蛋白，該蛋白含有N端甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和C端解旋酶結(jié)構(gòu)域；RNA2編碼2a蛋白，含有RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)結(jié)構(gòu)域；1a、2a與寄主因子組成病毒復(fù)制復(fù)合體(replication complex，RC)，負責(zé)病毒RNA的合成與復(fù)制[2]；另外，RNA2還通過其亞基因組RNA4A編碼一個RNA沉默抑制子2b蛋白[4-5]；RNA3編碼移動蛋白(MP)和外殼蛋白(CP)，負責(zé)病毒的移動和包裝[6]。Masuta等[7]發(fā)現(xiàn)CMV與TAV病毒RNA1或RNA2之間的交換不支持由RNA1、2和3組成的重組病毒的復(fù)制；但是，當(dāng)TAV RNA1和TAV RNA2與CMV RNA2和RNA3混合接種本生煙，會產(chǎn)生一個四分體病毒，該四分體病毒由TAV RNA1、CMV RNA2、CMV RNA3以及CMV與TAV的RNA2重組體組成，該RNA2重組體是在CMV RNA2的3’末端融合了TAV RNA2的3′末端140個堿基，這說明病毒基因組含有的RNA作用元件在異源1a-2a復(fù)制酶合成病毒RNA中扮演重要角色。

為了進一步深入研究異源復(fù)制酶組合的缺陷，本研究以CMV RNA1和TAV RNA2的異源組合作為研究對象，在本生煙植物體內(nèi)分析異源復(fù)制酶對重組病毒復(fù)制的作用，通過多次傳代的方法，嘗試?yán)貌《驹谥参矬w內(nèi)的自身變異來克服異源復(fù)制酶的不兼容性。

1 材料與方法

1.1 試劑

Q5超保真DNA聚合酶購于NEB公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購于TaKaRa公司；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞為本實驗室自制并保存于-80 ℃冰箱；常規(guī)生化試劑購于Sigma(上海)貿(mào)易有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 寄主植物

本氏煙(Nicotianabenthamiana)在植物生長室中培養(yǎng)，溫度22 ℃，光周期16 h/8 h(L/D)。待植物生長至5～6葉期，用于農(nóng)桿菌浸潤接種。

1.3 病毒侵染性克隆的構(gòu)建

根據(jù)Liao等[8]描述的CMV侵染性克隆構(gòu)建的方法，將CMV Fn株系和TAV BJ株系基因組的cDNA單個地克隆至pCB301雙元載體，從而構(gòu)建了含CMV基因組RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-C1、pCB301-C2、pCB301-C3，以及含TAV基因組RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-T1、pCB301-T2、pCB301-T3。構(gòu)建的所有質(zhì)粒均經(jīng)測序和病毒活性測試確定。

1.4 農(nóng)桿菌浸潤接種

將上述構(gòu)建的侵染性克隆通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。含侵染性克隆的農(nóng)桿菌在含有30 mg·L-1利福平、50 mg·L-1慶大霉素和50 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)14～16 h，離心收集菌體，懸浮于浸潤接種緩沖液(10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES和200 mmol·L-1乙酰丁香酮)，并將菌液濃度調(diào)至D600為0.5。按以下5種組合：C1C2C3、C1C2T3、C1T2C3、C1T2T3、T1T2T3，將攜帶相應(yīng)侵染性克隆的農(nóng)桿菌按等體積比進行混合，暗處放置3 h。用1 mL無菌注射器浸潤接種本氏煙葉下表皮。

1.5 病毒RNA的Northern雜交檢測

接種病毒14 d后，采集本氏煙頂端系統(tǒng)葉0.1 g，利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取葉組織總RNA，提取方法參考試劑指導(dǎo)手冊。病毒RNA的Northern雜交檢測參考文獻[9]。

1.6 病毒摩擦接種

剪取C1T2C3接種植物系統(tǒng)葉片，在研缽中加入5 mL接種緩沖液和少許金剛砂粉末，研磨成糊狀。在供接種葉片表面均勻撒少許金剛砂粉末，用研棒蘸取混合病葉汁液，單向地從葉基向葉尖方向輕輕涂抹2～3次，接種后1～2 min，用ddH2O沖洗葉片。

1.7 RT-PCR

從轉(zhuǎn)接C1T2C3 3代的感病本生煙植物上取0.1 g系統(tǒng)葉，并用TRIzol試劑提取其總RNA。以提取的總RNA為模板，用CMV和TAV基因組3′末端的反向引物CMV123R和TAV123R，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成病毒的第1鏈cDNA。然后以RT產(chǎn)物作為模板，用Q5 DNA聚合酶對C1T2C3的各個基因組進行PCR擴增。擴增的引物情況如下：CMVR1/2-F1與CMV123R擴增CMV RNA2的全基因組RNA，CMVR3-F1與CMV123R擴增CMV RNA3，CMVR3-F1與TAV123R擴增CMV RNA3的重組體，TAVR1/2-F1與TAV123R擴增TAV RNA2。引物序列如表1所示。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和膠回收，委托生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序結(jié)果用DNASTAR軟件中的Seqman程序進行序列比對和分析。

表1 PCR擴增病毒RNA所用的引物

Table 1 Sequences of primers for PCR amplifying viral genomic RNAs

2 結(jié)果與分析

2.1 CMV RNA1和TAV RNA2的異源組合對重組病毒復(fù)制的影響

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將假重組體(C1T2C3、C1T2T3和C1C2T3)及野生型(C1C2C3和T1T2T3)分別接種本氏煙，接種10 d后觀察癥狀。結(jié)果表明，接種C1C2C3組合的本氏煙中，其頂端系統(tǒng)葉出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒癥狀，包括植株矮化和頂端葉畸形卷曲；C1T2C3與C1T2T3接種的植物沒有出現(xiàn)明顯的病毒癥狀(圖1-A)。通過Northern雜交檢測了病毒在系統(tǒng)葉中的積累，結(jié)果顯示，同源復(fù)制酶組合的病毒，包括C1C2C3、T1T2T3和C1C2T3在侵染植物中有相當(dāng)?shù)姆e累，但是，在C1T2C3侵染的植物中，僅檢測到1條可能為RNA3重組體的條帶；在C1T2T3接種的植物中僅檢測到CMV基因組RNA3及其亞基因組RNA4的特異條帶。以上結(jié)果說明CMV RNA1和TAV RNA2的異源組合不能高效地支持重組病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制侵染。

2.2 C1T2C3的轉(zhuǎn)接增強了病毒的癥狀和病毒的積累

為了研究病毒的自發(fā)突變或重組能否克服異源復(fù)制酶的缺陷，選擇接種C1T2C3植株的系統(tǒng)葉，通過汁液摩擦接種的方法轉(zhuǎn)接健康本氏煙植株，記錄植物的癥狀表型，并分析病毒的積累情況。轉(zhuǎn)接3代之后，植物表現(xiàn)出頂葉卷曲畸形和植株矮小等明顯的病毒癥狀，該癥狀與C1C2C3的表型相似(圖2-A)。通過Northern雜交對植株系統(tǒng)葉中的病毒積累水平進行檢測，結(jié)果如圖2-B所示。C1T2C3經(jīng)轉(zhuǎn)接3代之后，與野生型病毒(C1C2C3)的基因組RNA積累水平相當(dāng)。由此推測，C1T2C3經(jīng)3代轉(zhuǎn)接之后，在植物體內(nèi)發(fā)生了自發(fā)突變或重組，從而導(dǎo)致病毒致病性增強和病毒積累增加。

2.3 C1T2C3病毒在植物體內(nèi)的自發(fā)突變和重組

為了分析C1T2C3經(jīng)3代轉(zhuǎn)接后增強的致病性和病毒積累是否由突變或重組所致，通過RT-PCR的方法，對病毒的3條基因組RNA進行了擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序。序列比對的結(jié)果顯示：CMV RNA1第1 390位堿基由G突變?yōu)锳，從而導(dǎo)致氨基酸從甲硫氨酸(Met)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)；TAV RNA2第1 695位堿基由U突變?yōu)锳，但不影響氨基酸序列；CMV RNA3的序列并沒有發(fā)生突變，但在其3′端融合了完整的TAV RNA2的3′ UTR。推測C1T2C3經(jīng)3次轉(zhuǎn)接之后，該重組病毒在植物體內(nèi)通過自發(fā)的突變和重組，克服了CMV 1a和TAV 2a復(fù)制酶組合的不兼容性，從而增強了病毒的致病性和復(fù)制水平。

3 結(jié)論與討論

本文通過研究CMV RNA1與TAV RNA2的異源重組，發(fā)現(xiàn)該異源重組不能有效地支持重組病毒C1T2C3和C1T2T3的復(fù)制，但是通過連續(xù)3次病毒傳代，重組病毒通過體內(nèi)的自發(fā)突變和重組很大程度上克服了異源復(fù)制酶的缺陷，這為深入研究異源復(fù)制酶不兼容性提供了良好的研究基礎(chǔ)。

*指示條帶可能是RNA3和RNA4的重組體* indicated bands probably being RNA3 and RNA4 recombinants圖2 C1T2C3重組病毒轉(zhuǎn)接3代后的病毒癥狀(A)和病毒RNA積累(B)Fig.2 Viral symptoms (A) and viral RNAs accumulation (B) of C1T2C3 after triple passages

雀麥花葉病毒科同屬病毒間異源復(fù)制酶的不兼容性已有報道，例如雀麥花葉病毒(BMV)與其同屬的豇豆褪綠斑駁病毒(Cowpeachloroticmosaicvirus，CCMV)[10]、CMV與其同屬的花生矮化病毒(Peanutstuntvirus，PSV)間異源復(fù)制酶不兼容[11]。雀麥花葉病毒科病毒的1a蛋白C端解旋酶結(jié)構(gòu)域與2a蛋白N端的140個氨基酸發(fā)生互作，是病毒復(fù)制所必需的[12-14]。Dinant等[3]發(fā)現(xiàn)，BMV與CCMV異源復(fù)制酶的不兼容性是由于它們不能發(fā)生互作。Suzuki等[11]發(fā)現(xiàn)PSV 1a與CMV 2a的互作對于異源重組病毒的復(fù)制是必需的，但不是充分的。本研究測序結(jié)果顯示，CMV RNA1的突變發(fā)生在第432位，位于N端甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域中，而TAV RNA2的突變則不影響2a蛋白的氨基酸序列，但是該病毒的突變或重組可以使病毒進行有效的復(fù)制積累，由此推斷，CMV RNA1編碼的1a蛋白和TAV RNA2編碼的2a蛋白在植物體內(nèi)能夠發(fā)生互作。以上CMV RNA1和TAV RNA2的點突變是否與該重組病毒克服異源復(fù)制酶組合的缺陷有關(guān)，仍需后續(xù)實驗的驗證。Masuta等[7]發(fā)現(xiàn)CMV與TAV病毒RNA1或RNA2之間的交換不支持由RNA1、RNA2和RNA3組成的重組病毒的復(fù)制，但當(dāng)TAV RNA1、TAV RNA2與CMV RNA2、CMVRNA3混合接種本生煙，會產(chǎn)生一個四分體病毒，該四分體病毒是由TAV RNA1、CMV RNA2、CMV RNA3和含有TAV RNA2 3′末端140堿基的CMV RNA2組成的重組體。說明TAV 3′ UTR與CMV病毒基因組RNA2的重組克服了異源復(fù)制酶的缺陷。本研究也發(fā)現(xiàn)，CMV RNA3的3′末端融合了TAV RNA2的完整3′ UTR序列，因此，推測CMV RNA3與TAV RNA2 3′ UTR的重組很可能與該重組病毒克服復(fù)制酶異源組合缺陷有關(guān)。

[1] PALUKAITIS P， GARCIA-ARENAL F. Cucumoviruses[J].AdvanceVirusResearch， 2003， 62: 241-323.

[2] JACQUEMOND M. Cucumber mosaic virus[J].AdvanceVirusResearch， 2012， 84： 439-504.

[3] DINANT S， JANDA M， KRONER P A， et al. Bromovirus RNA replication and transcription require compatibility between the polymerase-and helicase-like viral RNA synthesis proteins[J].JournalofVirology， 1993， 67(12):7181-7189.

[4] DING S W， ANDERSON B J， HAASE H R， et al. New overlapping gene encoded by thecucumbermosaicvirusgenome[J].Virology， 1994， 198(2): 593.

[5] BRIGNETI G， VOINNET O， LI W X， et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing inNicotianabenthamiana[J].EMBOJournal， 1998， 17(22): 6739-6746.

[7] MASUTA C， UEDA S， SUZUKI M， et al. Evolution of a quadripartite hybrid virus by interspecific exchange and recombination between replicase components of two related tripartite RNA viruses[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 1998， 95(18): 10487-10492.

[8] LIAO Q， TU Y， CARR J P， et al. An improvedcucumbermosaicvirus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs[J].ScientificReports， 2015， 5: 13178.

[9] XU A， ZHAO Z， CHEN W， et al. Self-interaction of thecucumbermosaicvirus2b protein plays a vital role in the suppression of RNA silencing and the induction of viral symptoms[J].MolecularPlantPathology， 2013， 14(8):803-812.

[10] ALLISON R F， JANDA M， AHLQUIST P. Infectiousinvitrotranscripts fromcowpeachloroticmottleviruscDNA clones and exchange of individual RNA components with brome mosaic virus[J].JournalofVirology， 1988， 62(10): 3581-3588.

[11] SUZUKI M Y M， YOSHINUMA T， HIBI T. Interaction of replicase components betweenCucumbermosaicvirusandPeanutstuntvirus[J].JournalofGeneralVirology， 2003， 84(7): 1931-1939.

[12] KAO C C， AHLQUIST P. Identification of the domains required for direct interaction of the helicase-like and polymerase-like RNA replication proteins ofbromemosaicvirus[J].JournalofVirology， 1992， 66(12): 7293-7302.

[13] O’REILLY E K， TANG N， AHLQUIST P， et al. Biochemical and genetic analyses of the interaction between the helicase-like and polymerase-like proteins of thebromemosaicvirus[J].Virology， 1995， 214(1): 59-71.

[14] O’REILLY E K， PAUL J D， KAO C C. Analysis of the interaction of viral RNA replication proteins by using the yeast two-hybrid assay[J].JournalofVirology， 1997， 71(10): 7526-7532.

(責(zé)任編輯 侯春曉)

Overcome the defect in virus replication conferred by heterogeneous combination of viral replicases through mutation and recombination

LU Jinda， LIAO Qiansheng， DU Zhiyou*

(CollegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou310018，China)

It is a common phenomenon that recombination of heterogeneous replicases cannot efficiently replicate recombinant virus in Bramoviridae. Here， the effects of heterogeneous combination of viral replicases on viral replication was investigated usingcucumbermosaicvirus(CMV) andtomatoaspermyvirus(TAV) as the research objectives， which are the typical species of the genusCucumovirus， Bromoviridea. CMV RNA1 (C1) and TAV RNA2 (T2) were heterogeneously combined， mixed with either CMV RNA3 (C3) or TAV RNA3 (T3)， and then inoculated ontoNicotianabenthamianaplants by agroinfiltration. At 10 days post-infiltration， no obvious viral symptoms were observed on the plants inoculated with C1T2C3 or C1T2T3. Moreover， mild viral bands were detected in the upper systemic leaves of the plants by Northern blot. These results demonstrate that C1T2 heterogeneous combination could not support viral replication/infection efficiently. When C1T2C3 was passaged three times， the infected plants showed obvious viral symptoms and a high accumulation level of viral progeny RNAs. Sequencing data of viral genomic RNAs showed that C1 had a mutation at the position 1 390， and T2 had a mutation at the position 1 695. Moreover， the 3′ end of C3 was tagged with the whole 3′ UTR of T2. Taken together， the recombinant virus C1T2C3 could overcome defects in virus replication conferred by the heterogeneous combination of their replicases byinvivomutation and recombination.

Cucumbermosaicvirus;Tomatoaspermyvirus; replicase; mutation; recombination

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.14

2009-09-18

國家自然科學(xué)基金項目(31470007)

盧金達(1990—)，男，浙江溫州人，碩士研究生，主要從事植物病毒分子生物學(xué)研究。E-mail: lujinda09@163.com

*通信作者，杜志游，E-mail: duzy@zstu.edu.cn

Q933

A

1004-1524(2017)03-0445-05

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 445-449

http://www.zjnyxb.cn

盧金達，廖乾生，杜志游. 突變和重組可克服異源復(fù)制酶在病毒復(fù)制中的功能缺陷[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 29(3): 445-449.