張娜， 閆亞茹， 武運*， 張宇宏*， 張偉

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，能夠?qū)Ｒ坏匮趸咸烟巧善咸烟撬岷瓦^氧化氫，具有脫氧、除葡萄糖、殺菌以及生成葡萄糖酸的作用[1]，近年來被廣泛用于與人體健康密切相關(guān)的食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等行業(yè)[2]。GOD 能夠有效地改善小麥面筋的組織結(jié)構(gòu)，提高面團的持氣性、彈性、韌性和持水性，從而改善面包品質(zhì)[3]；在白葡萄酒生產(chǎn)中加入GOD 可有效防止酚類對白葡萄酒產(chǎn)生的嚴(yán)重褐變[4]；GOD 催化產(chǎn)生的過氧化氫可充當(dāng)漂白劑在紡織品中使用[5]；在口腔護理產(chǎn)品中添加GOD 可起到抑制微生物的作用[6]；此外，GOD 是新型傳感器中的重要組成部分，可以用來測定糖含量[7]。

多種動植物和真菌都可產(chǎn)生GOD，而商業(yè)GOD 主要來源于黑曲霉和青霉菌發(fā)酵[8]。在發(fā)酵過程中，黑曲霉和青霉菌會生成過氧化氫酶和纖維素酶等其他副產(chǎn)物，產(chǎn)生的大量雜蛋白會使后期的分離純化工作變復(fù)雜，且增加生產(chǎn)成本。近年來研究發(fā)現(xiàn)，使用重組基因工程菌株表達葡萄糖氧化酶有望解決這些問題，在這其中，巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是更具高效生產(chǎn)GOD潛力的微生物[9-10]，Valdivieso-ugarte 等[11]克隆了黑曲霉BT18的葡萄糖氧化酶基因，并將其作為表達盒的一部分整合到釀酒酵母宿主菌株的核糖體DNA中，獲得了含有高達90%低聚果糖的最終糖漿。Li 等[12]將密碼子優(yōu)化的水仙凝集素（narcissus tazetta lectin，NTL）基因在畢赤酵母中成功表達，并在5 L 規(guī)模的發(fā)酵罐中發(fā)酵96 h 后得到重組NTL蛋白質(zhì)，產(chǎn)量高達1.2 g·L-1。周亞鳳等[13]將來源于黑曲霉的GOD 基因在畢赤酵母中進行了重組表達，誘導(dǎo)所得發(fā)酵液的酶活為30～40 U·mL-1。將克隆的GOD 基因與宿主表達載體連接后轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得基因工程菌株，通過甲醇誘導(dǎo)表達的方法可得到大量GOD 蛋白。畢赤酵母本身內(nèi)源蛋白的分泌量很少，且可以將外源目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，所以后期的蛋白純化操作較為簡單[14]。近年來，許多蛋白質(zhì)在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效表達，但仍然有多種蛋白質(zhì)表達量相對較低[15-16]。提高畢赤酵母外源蛋白質(zhì)的表達量是降低工業(yè)化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。

在畢赤酵母表達體系中，菌株、培養(yǎng)基以及發(fā)酵工藝等已經(jīng)逐漸成熟，構(gòu)建高效表達的載體是提高外源基因表達量的重要因素。利用畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，最常見的分泌信號是釀酒酵母α 信號肽（α mature factor）[17]。分泌信號由2 部分組成，一部分是19 個氨基酸的N-末端信號序列，指導(dǎo)易位進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）；另一部分是66 個氨基酸的蛋白區(qū)，介導(dǎo)受體依賴性包裝進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的COP Ⅱ轉(zhuǎn)運囊泡[18-19]，重組蛋白通過ER 腔中的Kex 2 蛋白酶去除α 因子信號序列。α 因子信號肽在畢赤酵母中能有效分泌多種異源蛋白質(zhì)，但不同蛋白的表達水平差異較大，因此，人們不斷探索新的方法改造信號肽，以提高蛋白表達水平或分泌效率。Tanaka 等[20]使用嗜酸性木聚糖酶自身信號肽、α 信號肽、酸性磷酸酶（PHO1）信號肽在GS115 中分泌表達顯示，α 信號肽引導(dǎo)的目的蛋白表達量是其他信號肽的2倍。Ghosalkar等[21]用IFN-α2自身信號肽及α 信號肽在畢赤酵母GS115 中分泌表達，結(jié)果表明，α 信號肽引導(dǎo)的目的蛋白高效分泌，產(chǎn)量達200 mg·L-1，而自身信號肽引導(dǎo)的目的蛋白不能分泌表達。應(yīng)用α信號肽也成功實現(xiàn)了Insulin、plectasin等多種蛋白在畢赤酵母中的高效表達[22]。以上研究結(jié)果表明，α 信號肽在應(yīng)用中較其他信號肽更為有效。為了在原有基礎(chǔ)上進一步提高蛋白表達和分泌效率，有必要對α 信號肽進行優(yōu)化升級。Lin-cereghino 等[23]利用釀酒酵母α 因子分泌信號的缺失誘變確定了可以被去除并改善分泌的氨基酸段，并利用這些結(jié)果為其潛在結(jié)構(gòu)生成模型。熊愛生等[24]通過在釀酒酵母的α因子信號肽序列N 端分別引入1～10 個畢赤酵母AOX1蛋白質(zhì)的N 端氨基酸構(gòu)建了10種不同的分泌信號肽序列，結(jié)果以N端加入A、I、P這3個氨基酸的信號肽序列對植酸酶基因的表達量影響最大。然而，目前關(guān)于通過改變信號肽核酸序列（氨基酸序列不變）而改善葡萄糖氧化酶表達量的研究尚未見報道。因此，本研究以重組表達GOD 的菌株AGODm-pPICZαA 為出發(fā)菌株，利用畢赤酵母密碼子偏好性對α 因子信號肽序列進行改造，重新構(gòu)建連有不同α信號肽的葡萄糖氧化酶重組表達酵母菌株，提高GOD 在畢赤酵母中的表達量，解決原始基因在畢赤酵母中表達量低的缺陷，進一步降低酶蛋白生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115、表達載體pPICZαA 及帶有葡萄糖氧化酶基因的質(zhì)粒AGODm-pPICZαA 均由本實驗室保存。

PCR 相關(guān)試劑和大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo 公司；抗生素Zeocin（100 mg·mL-1）購自Invitrogen 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；重組酶2×Clone Express Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；辣根過氧化物酶、鄰聯(lián)茴香胺、生物素和YNB（酵母無氨基氮源）購自Amresco 公司；其他普通化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

10×YNB：YNB 用 蒸 餾水 配 制為134 g·L-1，0.22 μm濾膜過濾滅菌。

500×生物素：生物素用蒸餾水配制為0.2 g·L-1，0.22 μm濾膜過濾滅菌。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，葡 萄 糖20 g·L-1，固 體 培 養(yǎng) 基 另 加 入15 g·L-1瓊脂粉，108 ℃下高壓滅菌30 min。

YPDZ固體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，葡 萄 糖20 g·L-1，瓊 脂 粉20 g·L-1，108 ℃下高壓滅菌30 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入Zeocin（300 μg·mL-1）。

LB 培 養(yǎng) 基：蛋 白 胨10 g·L-1，酵 母 提 取 物5 g·L-1，氯 化 鈉10 g·L-1，固 體 培 養(yǎng) 基 另 加 入15 g·L-1瓊脂粉，121 ℃下高壓滅菌20 min。

BMGY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，K2HPO43 g·L-1，KH2PO411.8 g·L-1，甘油1 g·L-1，121 ℃下高壓滅菌20 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入1/10 體積的10×YNB、1/500 體積的500×生物素。

BMMY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1，K2HPO43 g·L-1，KH2PO411.8 g·L-1，121 ℃下高壓滅菌20 min；待溫度下降至60 ℃以下，加入1/10 體積的10×YNB、1/500 體積的500×生物素和1%甲醇（體積分?jǐn)?shù)）。

1.2 儀器

主要儀器包括PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）、JS-680D 凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、立式高速離心機（日本HITACHI 公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、UV-2800 型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）、L-550 臺式大容量離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、平板搖床（德國Heidolph公司）。

1.3 不同α因子信號肽的優(yōu)化與載體構(gòu)建

1.3.1 α 因子信號肽的優(yōu)化與合成 試驗用表達載體為pPICZαA，信號肽為α 因子。在不改變α因子信號肽氨基酸序列的前提下，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性和mRNA 二級結(jié)構(gòu)能量，對α 因子信號肽DNA 序列進行重新設(shè)計，從而得到一系列新的信號肽DNA 序列。并計算其對應(yīng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index, CAI）（BitGene軟件），使用RNAfold WebServer 軟件預(yù)測mRNA二級結(jié)構(gòu)和能量，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行信號肽DNA合成。

1.3.2 α 因子信號肽與表達載體的重組 實驗室前期已經(jīng)構(gòu)建了葡萄糖氧化酶的重組表達載體AGODm-pPICZαA。根據(jù)不同信號肽序列，分別設(shè)計引物α-signal-F和α-signal-R，詳見表1。引物兩端各含有20 bp 與AGODm-pPICZαA 同源的序列。以α-signal-F 和α-signal-R 為引物，以合成的各信號肽DNA 為模板進行PCR 擴增，獲得各信號肽的PCR 擴增產(chǎn)物。PCR 體系如下：phanta 酶1 μL，2×phanta buffer 25 μL，dNTP 1 μL，引 物α-signal-F 2 μL，引物α-signal-R 2 μL，α 信號肽質(zhì)粒1 μL，ddH2O 18 μL。PCR 程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測后，進行瓊脂糖凝膠回收備用。

表1 基因擴增引物Table 1 Primers for gene amplification

設(shè)計引物ZT-pPICZαA-F 和ZT-pPICZαA-R（表1），以AGODm-pPICZαA 質(zhì)粒為模板進行PCR，PCR 方法同1.3.2，獲得含有GOD 基因表達盒的DNA 片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測后，進行瓊脂糖凝膠回收備用。將上述2種DNA片段與2×Clone Express Mix 重 組 酶 混 合，25 ℃反 應(yīng)15 min 后取出置于冰上靜置5 min，進行后續(xù)轉(zhuǎn)化操作。

1.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 將10 μL 上述重組產(chǎn)物加入到大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴30 min，在42 ℃水浴中熱激60 s 后立即置于冰上冰浴2 min，加入300 μL 的LB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床（200 r·min-1）孵育1 h，取200 μL 菌液，涂布含有Zecion（25 μg·mL-1）的LB 平板，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。待LB 平板轉(zhuǎn)化子長出后，通過PCR 方法進行鑒定，PCR 體系如下：Taq DNA 聚 合 酶0.4 μL，10×Easy Taq buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，引物α-signal-F 2 μL，引物3-AOX 2 μL，模板1 μL，ddH2O 10 μL。PCR 程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。陽性克隆即為連有不同信號肽的葡萄糖氧化酶重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，將其命名為α-signal-AGODm-pPICZαA。

1.3.4 重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS115中的表達 將陽性克隆接種到含Zecion（25 μg·mL-1）液體的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床（200 r·min-1）過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。使用SacⅠ限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒酶切線性化；然后加入0.8倍體積的異丙醇將線性化后的DNA 片段沉淀，75%乙醇清洗2 次，沉 淀 干燥后用15 μL 超 純水溶解，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取上述處理過的線性化質(zhì)粒10 μL，加入100 μL 畢赤酵母GS115 感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰上靜置20 min，2.5 kV 電擊6.0 ms 后，立即加入500 μL冰預(yù)冷的1 mol·L-1山梨醇溶液和500 μL的YPD培養(yǎng)基，28 ℃恒溫搖床（200 r·min-1）中孵育2 h。菌體涂布YPDZ 固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，直至酵母陽性克隆子長出。

1.4 重組葡萄糖氧化酶的誘導(dǎo)表達

挑取酵母陽性克隆子接種于含有500 μL BMGY 培養(yǎng)基的48 孔平板中，28 ℃恒溫振蕩（750 r·min-1）培養(yǎng)36 h；離心去除上清，菌體用500 μL BMMY 培 養(yǎng) 基 重 懸，28 ℃恒 溫 振 蕩（750 r·min-1）培養(yǎng)，每隔24 h 補加1%甲醇，培養(yǎng)72 h 后離心去除菌體，上清即為葡萄糖氧化酶粗酶液。

上述酶活力誘導(dǎo)表達重復(fù)進行4 次，用于確認篩選結(jié)果。

1.5 GOD酶活力測定和數(shù)據(jù)處理

在試管中加入除葡萄糖氧化酶之外的其余反應(yīng)底物（1.25 mL 的鄰聯(lián)茴香胺緩沖液；0.15 mL 的18%葡萄糖溶液；0.05 mL 的90 U·mL-1辣根過氧化物酶溶液），30 ℃保溫2 min 后，加入葡萄糖氧化酶溶液0.05 mL，反應(yīng)3 min 后，加入1 mL H2SO4（2 mol·L-1）終止反應(yīng)，測定540 nm 處的吸光值，根據(jù)制定的GOD 酶活測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算酶活力。使用Origin 8.5 軟件對GOD 酶活力數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

葡萄糖氧化酶(GOD)酶活單位（U）定義為：30 ℃、pH 6.0 條件下，每分鐘催化1 μmoL β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫所需的酶量。

1.6 重組葡萄糖氧化酶蛋白純化

使用截留分子量為10 kD 的超濾膜包對重組葡萄糖氧化酶進行脫鹽和濃縮，濃縮后的酶液采用陰離子交換層析柱HiTrap CaptoQ（5 mL）進行純化，詳細步驟參照文獻[6]。將純化后的5 種重組蛋白進行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α信號肽優(yōu)化及分析

2.1.1 5 種不同信號肽的優(yōu)化設(shè)計 以野生型信號肽αWT為基礎(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性和信號肽mRNA 二級結(jié)構(gòu)能量，設(shè)計了4 種不同信號肽α1、α2、α3與α4，5種α 信號肽序列比對結(jié)果如圖1 所示。α1和α2信號肽中使用了大量畢赤酵母最高頻率密碼子，而α3和α4信號肽則使用了大量畢赤酵母低頻率密碼子。

圖1 5種不同信號肽DNA序列比對Fig. 1 DNA sequence alignment of five different signal peptide

2.1.2 5 種不同信號肽的序列分析 根據(jù)5 種α信號肽各自的基因序列分析得到對應(yīng)的mRNA二級結(jié)構(gòu)，如圖2 所示，左側(cè)為每種信號肽的最小自由能結(jié)構(gòu)，右側(cè)是最小自由能結(jié)構(gòu)的山形圖。由各個信號肽的最小自由能（圖3）和密碼子適應(yīng)指數(shù)（圖4）可知，αWT信號肽的自由能為-53.8 kcal·moL-1；α1和α2信號肽中采用了高頻密碼子，密碼子適應(yīng)指數(shù)分別為0.96和0.82，自由能分別為-46.9 和-54.2 kcal·moL-1；而α3和α4信號肽對應(yīng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)分別為0.46 和0.40，自由能分別為-91.7和-99.9 kcal·moL-1。

圖2 5種 α 信號肽mRNA二級結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Secondary structure of five α-signal peptide mRNAs

圖3 5種α信號肽的mRNA二級結(jié)構(gòu)能量Fig. 3 mRNA secondary structure energy of five α-signal peptides

圖4 5種α信號肽的密碼子適應(yīng)指數(shù)Fig. 4 Codon adaptation indices of five α-signal peptides

2.2 連接不同α 信號肽的重組菌株的葡萄糖氧化酶活力

將優(yōu)化后的4 種信號肽與野生型信號肽分別在畢赤酵母GS115 中進行表達，電擊轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母后，每種信號肽對應(yīng)的重組菌株均含有200 個以上重組子，各隨機選取24 個單克隆進行酶液誘導(dǎo)。將含各種信號肽的重組菌株酶活力分別與含野生型信號肽的重組菌株酶活力進行對比。結(jié)果（圖5）顯示，αWT信號肽對應(yīng)重組菌株的平均酶活力為5.32 U·mL-1；連有α1、α2信號肽重組菌株的GOD 酶活力明顯高于野生型菌株。其中連有α1信號肽重組菌株的平均酶活力10.74 U·mL-1，是野生型αWT的2.01 倍；連有α2信號肽重組菌株的酶活力是9.62 U·mL-1，是野生型αWT的1.80 倍；而連有α3、α4信號肽重組菌株的酶活力明顯降低，其中α4信號肽重組菌株酶活力僅為野生型αWT的41%。

圖5 不同信號肽重組菌株及野生型信號肽重組菌株的GOD酶活力Fig. 5 GOD enzyme activity of recombinant strains with different signal peptides and recombinant strains containing wild-type signal peptides

上述結(jié)果經(jīng)驗證具有可重復(fù)性（圖6），與αWT信號肽重組菌株相比，α1的表達量遠高于野生型；而使用低頻率密碼子構(gòu)建的α4信號肽重組菌株的酶活力最低，遠低于野生型。

圖6 酶活力平均值Fig. 6 Enzyme activity average

2.3 重組葡萄糖氧化酶SDS-PAGE分析

粗酶液經(jīng)10 kD 的超濾膜包脫鹽及HiTrap CaptoQ 陰離子交換層析柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組GOD與野生型GOD蛋白的分子量大小一致，均為80 kD左右（圖7）。

圖7 重組菌株GOD的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of recombinant strains GOD

3 討論

大多數(shù)氨基酸由多個密碼子編碼，在各種宿主中，密碼子的選擇對蛋白質(zhì)的表達有重要影響。Goodman 等[25]建立并測量了大腸桿菌中14 000 多個合成報告基因的表達，表明用N 端稀有密碼子代替普通密碼子可使蛋白表達量增加14 倍（中位數(shù)4 倍）。mRNA 分子中的同義密碼子突變可改變DNA 序列的化學(xué)特性及其翻譯速率。但是，由于共翻譯錯誤折疊，密碼子翻譯速率的變化可能導(dǎo)致新生蛋白質(zhì)發(fā)生功能異常[26]。

釀酒酵母α因子信號肽目前是畢赤酵母中使用最多且成功率最高的信號肽。Barrero等[27]設(shè)計了1 種由釀酒酵母Ost1 信號序列組成的分泌信號，與使用原始α 因子分泌信號肽所獲得的表達水平相比，該信號肽序列將紅色熒光蛋白E2-Crimson 提 高 了20 倍，脂 肪 酶BTL2 增 加 了10倍。Lsada-lombana等[28]通過信號肽和PMP1t促進共同翻譯易位導(dǎo)致蛋白的胞外水平升高，使細胞外mRFP 和β-葡萄糖苷酶的水平分別提高了5.8和7.1倍。

信號肽提高了重組蛋白在畢赤酵母中的表達水平，其原因是α 信號肽能夠介導(dǎo)新生肽翻譯并同時轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔表面，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。這種效應(yīng)與信號肽本身共翻譯轉(zhuǎn)運途徑的功能及信號肽疏水核心的疏水強度有密切關(guān)系。信號肽疏水性的增強可以提高信號肽的轉(zhuǎn)運效率。Oberste等[29]研究發(fā)現(xiàn)，酵母PhoA 信號肽疏水核心Leu/Ala 值為6∶4 時，信號肽分泌能力隨著疏水性的增強而提高，此時前體蛋白質(zhì)能較好地分泌。

自由能是衡量mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素，能量值越小，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，但越不利于后期的解折疊及翻譯。本研究中，α4信號肽自由能為-99.9 kcal·moL-1，能量值最小，GOD的表達量也最低。而對應(yīng)的，α1信號肽自由能為-46.9 kcal·moL-1，在各組信號肽中能量值最高，其GOD 表達量也最高。本研究并未改變目的蛋白的DNA和氨基酸序列，也未改變信號肽的氨基酸序列，僅通過優(yōu)化信號肽的密碼子改變其mRNA結(jié)構(gòu)，從而改變了GOD蛋白的表達量，揭示了畢赤酵母表達框N 端的mRNA 結(jié)構(gòu)可能對外源蛋白表達有較大影響。因此本研究提供了1 種新的改善畢赤酵母外源蛋白表達量的策略，但后期仍需要通過多種不同外源蛋白進行驗證。

本研究在不改變氨基酸序列的前提下，對畢赤酵母α 因子信號肽進行改造，使用畢赤酵母高頻密碼子的α1、α2信號肽，其對應(yīng)重組菌株的GOD 酶活力明顯高于野生型，最高可達野生型的2.01 倍；而使用畢赤酵母低頻密碼子且自由能較低的α3、α4信號肽，其對應(yīng)重組菌株的酶活力低于野生型，最低僅為野生型的41%。