李海英

我校于2009年建立了簡易生物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。在初中階段開展組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)面臨著技術(shù)和條件上的困難。為了更好地開展組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，自組織培養(yǎng)室建立以來，我們一直進(jìn)行植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索，通過外出學(xué)習(xí)、拉練觀摩、上網(wǎng)查詢等方式完善組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程，取得了點(diǎn)滴成績。本文以菊花的組織培養(yǎng)為例，詳細(xì)論述初中階段組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開展情況。

一、面臨的困難

學(xué)校缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室和儀器設(shè)備，沒有專職的植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教師，負(fù)責(zé)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)的教師往往擔(dān)任幾個(gè)班的生物課教學(xué)工作，針對這種現(xiàn)狀，就要求植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教師根據(jù)現(xiàn)有條件利用好有限的時(shí)間，創(chuàng)造性地開展工作，以最低的成本、最少的時(shí)間順利完成植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)室

兩個(gè)房間80 m2左右，一間用于玻璃器皿的清洗和貯存以及培養(yǎng)基的制備，另一間用做培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，在清洗玻璃器皿和制備培養(yǎng)基時(shí)要分開進(jìn)行，以免影響培養(yǎng)基的成分。

三、儀器設(shè)備

天平、冰箱、高壓滅菌鍋(可用家用高壓鍋代替)電爐、超凈工作臺、酒精燈、解剖刀、鑷子、解剖剪、三角瓶、可調(diào)移液器(10 uL，200 uL)、烘干箱、大細(xì)口瓶或塑料瓶、封口膜、pH試紙、培養(yǎng)皿。其中大部分可從生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中找到。

四、實(shí)驗(yàn)藥品

干粉，1 mg/mL 6-BA，0.5 mg/mL NAA，10%NaOH溶液，10%的NaClO溶液(可用0.1%升汞溶液或84消毒液代替)，70%的酒精，pH試紙，蛭石，珍珠巖，無菌水。

五、實(shí)驗(yàn)的開展

可將學(xué)生分成若干組，每組成員3～5名，不宜太多，否則效果不好。

六、選材

這個(gè)步驟十分關(guān)鍵，需要選擇一些容易成活、容易操作的草本植物，比如菊花、煙草等。一方面可以提高幼苗的成活率，另一方面可以適當(dāng)省略其中的一些步驟，減少教師的工作量，減輕負(fù)擔(dān)，節(jié)省時(shí)間，否則可能會出現(xiàn)將來移栽煉苗時(shí)成活率不高，打擊學(xué)生的積極性，達(dá)不到預(yù)期目的。

七、實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)過程以菊花為例。

1.選材及處理

外植體如果是無菌苗最好，可直接接種。如果不是，需進(jìn)行以下處理：選取菊花的莖頂端、嫩莖段或葉片，其中莖頂端可直接生根，其余生芽，現(xiàn)以莖段為例，取帶1～2個(gè)芽的菊花嫩莖段若干，先用洗衣粉清洗，然后用自來水沖洗20 min(用紗布包住材料系在水龍頭上打開即可)，然后置于超凈工作臺上，用70%的酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3次，用10%的NaClO溶液消毒20 min(可用0.1%升汞溶液或84消毒液來代替)無菌水沖洗2～3次，這樣就可以接種了(消毒的時(shí)間可靈活掌握，一般幼嫩的組織時(shí)間要少一些，老組織需要時(shí)間長一些)。

2.培養(yǎng)基的配制

建議直接購買干粉，這樣可節(jié)省很多時(shí)間和精力，把干粉加熱融化后加入6-BA，NAA。以配制1 L培養(yǎng)基為例，外植體為葉時(shí)需加入1 mg/mL 6-BA 2mL，0.5 mg/mL NAA 1mL；外植體為芽時(shí)加入1 mg/mL 6-BA 3mL，0.5 mg/mL NAA 0.2mL。誘導(dǎo)生根時(shí)加入0.5 mg/mL NAA 0.2mL，然后用pH試紙檢測pH值是否為5.8，如果過小就加入NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)(pH值過小培養(yǎng)基不易凝固，過大則培養(yǎng)基太硬影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收)。調(diào)好后就可以分裝入三角瓶中，每個(gè)三角瓶中20mL左右，蓋上瓶蓋或封口膜，放入滅菌鍋或高壓鍋中消毒20 min后取出即可使用，如果缺少三角瓶可用廣口瓶、罐頭瓶或燒杯來代替。缺少封口膜可將剪成正方形的塑料紙對折兩次，用燒熱的鐵釘在中央燙幾個(gè)小洞，然后用牛皮紙或?yàn)V紙塞入塑料紙中，將洞全部遮住即可使用，這樣可根據(jù)自己的需要做出任意大小的封口膜。

3.接種

超凈工作臺在接種前30 min開紫外燈，前10 min送風(fēng)，接種器械和器皿可先放在滅菌鍋或高壓鍋中滅菌20 min，取出后放入烘干箱中烘干備用。接種時(shí)接種人先洗凈雙手，換好專用實(shí)驗(yàn)服，上超凈工作臺后，點(diǎn)燃酒精燈，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處，然后擦拭工作臺面；再將鑷子、剪刀、解剖刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處(如果鑷子、剪刀、解剖刀和培養(yǎng)皿沒有經(jīng)過高壓蒸氣滅菌，可先用酒精棉球擦拭再將鑷子、剪刀和解剖刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干)，接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等。每次用過的器械都要重新進(jìn)行消毒后再使用。

4.培養(yǎng)

接種后放在光照培養(yǎng)箱或光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，溫度控制在23～25 ℃。如果所用的菊花的莖帶有頂芽，10天左右就可以生根，如果是其他部分則要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，再分化出芽，然后接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)生根培養(yǎng)(如圖1所示)。

圖1

5.浸染問題

若接種后1～2天發(fā)現(xiàn)被污染為細(xì)菌污染，若3～10天才發(fā)現(xiàn)被污染則主要是霉菌污染。發(fā)現(xiàn)有污染后需立即移走處理掉否則可能污染其他試管苗。如果一瓶中只在培養(yǎng)基中出現(xiàn)了污染，沒有接觸到外植體，可將外植體轉(zhuǎn)移到其他的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，外植體有可能成功保留。

6.煉苗

先在室溫條件下閉瓶鍛煉3天，再開瓶鍛煉3天。

7.移栽

當(dāng)菊花的根長到3 cm左右比較發(fā)達(dá)時(shí)，就可進(jìn)行移栽，具體過程是：去凈瓊脂，可先在滅過菌的珍珠巖或蛭石上培養(yǎng)再轉(zhuǎn)移到土壤中。對于菊花來說，直接移栽到土壤中即可成活。

八、結(jié)束語

近年來生物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種方面得到廣泛的應(yīng)用，大大提高了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。在園藝學(xué)上應(yīng)用也非常廣泛，特別是對于初中學(xué)生，如果能掌握這門技術(shù)，對自身發(fā)展十分有利，所以每位參與植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教師需共同努力、認(rèn)真研究、科學(xué)探索、靈活運(yùn)用，只有這樣才能探索出更多的植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)成果，讓盡可能多的學(xué)生接觸到并掌握這項(xiàng)技術(shù)，對促進(jìn)初中植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的發(fā)展意義重大。

[1]高亞紅.植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索[J].教學(xué)儀器與實(shí)驗(yàn),2010(12):34.