金 蘭，張海晶，陳大忠

(黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040)

五味子為木蘭科(Mrgnoliaceae)植物Schisandra chinensis(Turcz.)Bail.的干燥成熟果實，習稱“北五味子”[1]，是著名的滋補性中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品.我國五味子資源豐富，分布廣泛，主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古等地[2].五味子果實有益氣生津，斂肺滋腎，止瀉，澀精，安神的作用，可治久咳虛喘，津少口干，遺精久瀉，健忘失眠等癥[3].北五味子中化學成分為揮發(fā)性成分、木脂素類、有機酸類、多糖類、苷類、其他成分等[4].五味子多糖味酸、甘、溫，具有收斂固澀，補腎寧心，益氣生津之功效[5].在工藝優(yōu)化過程中，常需同時考察多個因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進行優(yōu)化.國內(nèi)常用均勻設(shè)計和正交設(shè)計，但該兩種方法實驗精度不夠，建立的數(shù)學模型預(yù)測性較差.國外近年來常用星點設(shè)計－響應(yīng)面優(yōu)化法，是由于該法試驗次數(shù)少，信息量大，直觀，采用非線性預(yù)測模型，在中心點進行重復試驗以提高精度，使預(yù)測值更接近真實值[6－8].本實驗采用星點設(shè)計－響應(yīng)面法對五味子多糖的提取工藝進行優(yōu)化研究，為五味子多糖類化學成分研究提供科學參考.

1 材料與儀器

1.1 材料

實驗藥材采自于黑龍江省清河育林林場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為北五味子S.chinensis的干燥果實.

1.2 儀器與試劑

756PC型可見光紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，R－201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司).葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇均為分析純，水為雙蒸水.

2 方法與結(jié)果

2.1 星點實驗設(shè)計

根據(jù)文獻報道和預(yù)試驗，選擇對工藝影響較大的因素，分別為提取溫度、提取時間、溶劑倍數(shù)和提取次數(shù).因提取次數(shù)屬于非連續(xù)變量，回歸處理較棘手，且預(yù)測值精度不能控制，固定提取3次.根據(jù)響應(yīng)面分析法中中心組合設(shè)計(Central Composite)的原理，每個因素設(shè)5水平，分別用代碼－α，－1，0，1，+α來表示，代碼所代表的實際物理量見表1.

2.2 北五味子多糖得率的測定

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取已干燥至恒重的北五味子果實10.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入一定體積雙蒸水，放入水浴中按恒定溫度回流提取一定時間，過濾，提取3次，合并提取液.所得提取液濃縮至每1 mL含2 g生藥，冷卻后，攪拌下緩慢加入4倍體積的乙醇，混合均勻，放置在4℃冰箱醇沉24 h，以5 000 r/min離心20 min.所得沉淀，蒸干乙醇，得浸膏即為五味子多糖，并將該浸膏用雙蒸水定容于250 mL量瓶中.

表1 星點設(shè)計因素水平表

2.2.2 標準曲線的制備

精密稱取100.18 mg已干燥至恒重的標準葡萄糖，置于100 mL量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻，得葡萄糖標準溶液.精密量取葡萄糖標準溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，并用雙蒸水定容至刻度，搖勻.取各濃度的標準液1.0 mL分別置于試管中，加入5%苯酚溶液2.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.8 mL，搖勻，室溫放置15 min，30 ℃水浴中放置15 min，在波長為486 nm處測定吸光度值.以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，得回歸方程Y=6.7 × 10－3X+2.39 × 10－2，相關(guān)系數(shù) r=0.9984，線性范圍是 10.018 ～100.18 μg.

2.2.3 精密度考察試驗

精密吸取上述標準葡萄糖溶液1.0 mL，重復測定5次，標準葡萄糖溶液吸光度的RSD值為0.31%，表明此測定方法精密度良好.

2.2.4 穩(wěn)定性考察試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、5、10、20、30、40 min內(nèi)進行測定，其吸光度 RSD值為1.34%，表明供試品溶液在40 min內(nèi)顯色穩(wěn)定.

2.2.5 重復性考察試驗

精密吸取按照“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法來制備的同一批五味子提取液6份，以雙蒸水為空白溶劑，按照“2.2.2”項下方法進行平行處理，在486 nm處測定吸光度值，并計算出平均多糖得率為4.71%，RSD值為1.65%，表明該法具有良好的重復性.

2.2.6 加樣回收率試驗

取已知含量北五味子藥材6份，每份精密稱取10.0 g.置于圓底燒瓶中，精密加入適量標準品，按照“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制備，精密吸取1.0 mL 供試品溶液，并按“2.2.2”項下方法顯色處理，在486 nm波長處測定吸光度，計算出加樣回收率平均值為99.12%，RSD值為0.98%，表明測定方法準確度較好.

2.2.7 北五味子多糖得率的測定

精密吸取供試品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，雙蒸水定容，搖勻.精密量取1.0 mL于試管中，加入2.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸6.8 mL，搖勻，室溫放置 15 min，30 ℃ 水浴中放置15 min，在486 nm處測定吸光度值.同時取相同體積雙蒸水作為空白溶液，進行平行試驗.

2.3 統(tǒng)計分析

精密稱取已干燥至恒重的北五味子10.0 g，按表2試驗號及上述方法進行提取和測定，測定北五味子中的多糖得率，試驗安排與結(jié)果見表2.

表2 北五味子多糖提取工藝星點試驗設(shè)計及結(jié)果

將所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件Design－Expert 7進行響應(yīng)面分析，以多糖得率(Y)為因變量對各因素(X1、X2、X3)進行多元線性回歸和二項式方程擬合.經(jīng)軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行分析，擬合模型如下:多元線性回歸方程:

二項式擬合模型方程:

根據(jù)上述結(jié)果分析，多元線性回歸R2=0.639 2，P=0.02，模型不能通過檢驗，模型擬合度不高，預(yù)測性較差，因此不采用多元線性回歸方程擬合.二項式擬合模型 R2=0.977 9，P ＜0.000 1，對方程中的各項系數(shù)進行方差分析(見表3)，刪除不顯著因素，方程簡化為:

由表3結(jié)果可以看出提取溫度和溶劑倍數(shù)對多糖得率有極顯著的影響，提取時間無顯著影響.二項式擬合模型方程失擬性(P＞0.05)，符合模型要求;二項式模型(P＜0.000 1)，有極顯著水平，說明該方程擬合度良好，有較好的預(yù)測作用，可利用該模型分析最佳提取工藝條件.

表3 二項式擬合模型方差分析結(jié)果

續(xù)表3 二項式擬合模型方差分析結(jié)果

2.4 工藝參數(shù)優(yōu)化與預(yù)測

因響應(yīng)面只能表達2個因素的函數(shù)，所以固定3個因素中的1個為中值，即因變量與2個自變量擬合為三維曲面圖，繪制因變量效應(yīng)曲面圖(見圖1～3)，并結(jié)合簡化后的二項式模型方程進行預(yù)測分析，多糖得率最大值為6.36%，最優(yōu)工藝為:水為溶劑，提取溫度為92℃，提取時間為171.6 min，溶劑倍數(shù)為21.55倍，提取3次.

圖1 溫度和提取時間對多糖得率的影響

圖2 提取時間和溶劑倍數(shù)對多糖得率的影響

圖3 溫度和溶劑倍數(shù)對多糖得率的影響

2.5 驗證試驗

根據(jù)最優(yōu)工藝條件進行驗證，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制備和按“2.2.2”項下方法對樣品顯色處理，平行做3組，實際測定得到多糖得率為 5.49%(RSD=1.46%，n=3，預(yù)測值為 6.36%).該結(jié)果表明，所建立的模型可靠，具有良好地預(yù)測性及所選工藝條件重現(xiàn)性良好.

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)活性多糖具有抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力、延緩衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗輻射等功效，其作用日益受到人們的重視.五味子多糖是從五味子干燥成熟果實中可直接用水提取的混合物，具有保肝、抗疲勞、增強免疫、抗氧化及抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤等藥理作用.本實驗為了充分發(fā)揮五味子多糖的功效，以多糖得率為考察指標，對北五味子多糖提取工藝進行優(yōu)化，為北五味子多糖提取工藝相關(guān)行業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ).星點設(shè)計－響應(yīng)面優(yōu)化法是多因素5水平的實驗設(shè)計，通過預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，確定合理的因素水平范圍;并采用非線性擬合模型，并在中心點進行重復性試驗提高其精確度，從而使預(yù)測值更接近實際值.本實驗進行預(yù)試驗的前提下，運用3因素5水平星點設(shè)計－響應(yīng)面優(yōu)化法對北五味子多糖提取工藝進行了優(yōu)化.并最終確定最優(yōu)工藝條件為以水為溶劑，在92℃下，用21.55倍量溶劑回流提取3次，每次171.6 min中，提取實際值與預(yù)測值偏差為－0.87%.此方法可用于北五味子多糖提取工藝行業(yè)中，是一種適用性廣，簡單合理，穩(wěn)定性好，可預(yù)測性強的提取方法.

[1]中國藥典一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.61.

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