賀建東 韓沖芳 董玥穎 雒珉 王曉鵬

心肌缺血再灌注損傷常在進(jìn)行冠狀動脈旁路移植術(shù)、急性心肌梗死溶栓術(shù)及CPB下心內(nèi)直視手術(shù)等治療時發(fā)生。研究表明，七氟烷預(yù)處理、后處理及兩者聯(lián)合處理均可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，具體機制尚未完全闡明[1-3]。研究表明，血紅素氧合酶-1（HO-1）基因轉(zhuǎn)染可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[4]。本研究擬評價七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠心肌缺血再灌注時HO-1表達(dá)的影響，為明確七氟烷的心肌保護(hù)作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠40只（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（晉）2009-0001），體重250～280 g。儀器：七氟烷揮發(fā)罐（aeommedvp 3000），ALC-V 8動物呼吸機（上海奧爾特生物科技有限公司），麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀（vamos,德國Draeger Medical AG&Co.KgaA）。

1.2 主要藥品和試劑 (1)主要藥品：七氟烷（sevoflurane，批號：9520，丸石制藥株式會社）；(2)試劑：CK-MB試劑盒（上海羅氏公司），HO-1兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司bs-0827 R)，PV-6001二步法免疫組化檢測試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備 實驗前動物禁食8 h，自由飲水，10%水合氯醛0.3 mL/kg行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，針狀電極連續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。頸部正中切口，分離氣管，氣管切開，連接動物呼吸機行機械通氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量6～7 mL，吸∶呼=1∶2，吸入純氧，氧流量為1 L/min，麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀與氣管導(dǎo)管連接，用于監(jiān)測呼氣末七氟烷濃度，七氟烷揮發(fā)罐與動物呼吸機進(jìn)氣端連接，用于調(diào)節(jié)吸入七氟烷的濃度。在左側(cè)胸壁胸骨左緣0.5 cm處第3、4肋間打開胸腔，剪開心包，暴露心臟。用6-0絲線在左心耳根部與肺動脈圓錐之間穿過左冠狀動脈前降支（LAD），絲線兩端穿聚乙烯小管(直徑0.1 cm，長0.5 cm)，拉緊細(xì)線，用止血鉗夾閉小管，即可阻斷LAD，心電圖示ST段抬高，T波高聳，結(jié)扎線下心肌組織發(fā)紺并活動減弱，說明心肌缺血模型成功。30 min后松開止血鉗，使LAD恢復(fù)血流，ST段下降，發(fā)紺區(qū)逐漸變紅示心肌再灌注成功。結(jié)扎前出現(xiàn)心電圖不正常或未到觀察終點而死亡的大鼠排除本研究。

1.4 動物分組 實驗動物隨機分為5組（n=8）：假手術(shù)組（S組）、心肌缺血再灌注組（I/R組）、七氟烷預(yù)處理組（S-Pre組）、七氟烷后處理組（S-Post組）、七氟烷預(yù)處理聯(lián)合后處理組（S-Pre+S-Post組）。除S組外均采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型，S組只穿線，不結(jié)扎；S-Pre組缺血前30 min吸入1 MAC的七氟烷15 min，洗脫15 min；S-Post組再灌注前10 min吸入1MAC的七氟烷15min；S-Pre+S-Post組缺血前30 min吸入1MAC的七氟烷15 min，洗脫15 min，再灌注前10 min吸入1 MAC的七氟烷15 min。

1.5 血清CK-MB水平測定 于實驗結(jié)束時迅速腹主動脈取血2 mL，離心后按試劑盒說明在日立7600型全自動生化分析儀上測定CK-MB含量。

1.6 心肌梗死面積測定 再灌注結(jié)束后原位結(jié)扎冠狀動脈，經(jīng)主動脈逆行灌注1%的Evans藍(lán)2～3 mL，待非缺血區(qū)心肌充分染成藍(lán)色后摘取心臟，剪除大血管、心房及右心室，置于-20℃冰箱中20 min，從心尖向心底部將左室切成厚2～3 mm的切片，置入0.5%氯化硝基四氮唑藍(lán)磷酸緩沖液中（pH=7.4），37℃水浴18 min，冷生理鹽水沖洗染料，10%甲醛溶液固定。染成藍(lán)色的區(qū)域代表非缺血區(qū)，紅色區(qū)域（含白色區(qū)）代表缺血區(qū)（AAR），白色區(qū)域代表壞死區(qū)（AN），沿不同顏色的邊緣切下不同區(qū)域并稱重，心肌梗死面積以壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量(AN/AAR)來表示。

1.7 心肌組織病理變化和HO-1蛋白表達(dá)測定 再灌注120 min后剪下心肌組織，迅速分離出左心室，置于4%中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下（×100）觀察各組心肌病理學(xué)變化。免疫組織化學(xué)方法測HO-1蛋白表達(dá)，切片按照PV-6001二步法免疫組化說明書進(jìn)行。光鏡下（×400）觀察，陽性反應(yīng)為胞漿呈棕黃色，每張切片隨機選取5個視野，利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域平均光密度值（optical density,OD），以O(shè)D值代表HO-1蛋白陽性產(chǎn)物的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，組間進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與S組比較，其余4組血清CK-MB水平增高，心肌梗死面積增加，心肌組織HO-1表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與I/R組比較，S-Pre組、S-Post組和S-Pre+S-Post組血清CK-MB水平降低，心肌梗死面積減小，心肌組織HO-1表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與S-Pre組和S-Post組比較，S-Pre+S-Post組血清CK-MB水平降低，心肌梗死面積減小，心肌組織HO-1表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組血清CK-MB水平、心肌梗死面積和心肌HO-1含量比較(±s,n=8）

表1 各組血清CK-MB水平、心肌梗死面積和心肌HO-1含量比較(±s,n=8）

注：與S組比較，aP＜0.05與I/R組比較，bP＜0.05與S-Pre組和S-Post組比較，cP＜0.05

S組 8 187.32±55.19 0 0.12±0.03 IR組 8 2587.02±512.66a 30.56±2.12a 0.25±0.05a S-Pre組 8 1856.84±421.78ab 16.61±1.64ab 0.37±0.07ab S-Post組 8 1771.43±328.95ab 15.67±1.55ab 0.40±0.10ab S-Pre+S-Post組 8 1038.56±317.08abc 10.86±1.43abc 0.54±0.11abc

光鏡下觀察心肌組織病理變化。S組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，間質(zhì)無水腫，橫紋排列整齊。I/R組心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫明顯，胞漿染色變淺，細(xì)胞間邊界模糊，大部分橫紋消失。S-Pre組和S-Post組心肌病理變化基本相同，介于I/R組和S-Pre+S-Post組間，S-Pre+S-Post組心肌纖維排列基本整齊，細(xì)胞輕度水腫，部分間質(zhì)水腫輕度增寬。

3 討論

本實驗參照文獻(xiàn)[3]采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型。結(jié)果表明，與S組比較I/R組大鼠血清CK-MB水平增高，心肌梗死面積增加，心肌組織HO-1表達(dá)增高，結(jié)合心電圖和病理學(xué)結(jié)果，說明模型制備成功。

CK-MB是心肌細(xì)胞所特有的，具有高度的敏感性和特異性，因此CK-MB可作為判斷心肌細(xì)胞損傷程度的敏感指標(biāo)[5]。本實驗采用血清中的CK-MB的濃度來判斷心肌損傷的情況。本研究中，七氟烷預(yù)處理、七氟烷后處理及二者聯(lián)合處理都能明顯降低血漿CK-MB水平，心肌細(xì)胞變性壞死減輕，對缺血再灌注心肌起到保護(hù)作用，且聯(lián)合處理組心肌保護(hù)作用強。心肌梗死面積是判斷心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其測定有助于判斷心肌損傷的程度[2]。本研究中，各七氟烷處理組的心肌梗死面積較I/R組減小且聯(lián)合處理組最小，說明七氟烷能有效地降低心肌細(xì)胞的損傷。

血紅素氧合酶（Hemo oxygenase，HO）有3種同工酶形式，其中HO-1是一種誘生型的應(yīng)激蛋白，可被多種刺激誘導(dǎo)而表達(dá)增高，缺血再灌注等因素誘導(dǎo)可顯著增加酶活性，進(jìn)一步促進(jìn)血紅素的分解代謝，發(fā)揮細(xì)胞、組織、器官的保護(hù)作用。Katori等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HO-1過度表達(dá)參與大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其作用機制與HO-1催化血紅素降解產(chǎn)生膽綠素、CO和Fe2+有關(guān)。膽綠素與其還原產(chǎn)物膽紅素通過清除羥基、O2、脂質(zhì)過氧化物酶等保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[7]，CO可反饋抑制NO大量合成，減輕氧化損傷，F(xiàn)e2+可通過調(diào)節(jié)鐵蛋白的合成清除體內(nèi)氧自由基[8]。CO是體內(nèi)重要的氣體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，與HO-1構(gòu)成的HO-1/CO系統(tǒng)也具有很強的抗氧化作用[9]。在本實驗中，與I/R組相比七氟烷各處理組心肌HO-1蛋白表達(dá)水平增加，提示七氟烷通過上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)，來降低缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，且聯(lián)合處理組心肌保護(hù)作用較強。而七氟烷是通過什么途徑上調(diào)HO-1的表達(dá)而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，與單純七氟烷預(yù)處理或后處理比較，兩者聯(lián)合處理在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用要強，這種保護(hù)作用可能是通過部分上調(diào)HO-1表達(dá)來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)而實現(xiàn)的。

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