劉艷

結(jié)核是我國的重大傳染病之一，也是威脅全球健康的呼吸道傳染病。近年來，結(jié)核病有明顯上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球目前有約20億的人感染過結(jié)核分枝桿菌[1]。如何快速準(zhǔn)確的診斷活動性結(jié)核患者對結(jié)核病的防控尤為重要。傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片敏感性僅有50%～60%。分枝桿菌培養(yǎng)是目前臨床上應(yīng)用于結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其需等6～8周時間才能有結(jié)果，培養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)陽性率偏低。目前對菌陰肺結(jié)核、兒童結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷仍比較困難。本研究通過對49例確診結(jié)核患者及47例非結(jié)核患者行T-SPOT.TB檢查，探討其在結(jié)核病的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2011年3月～2012年8月我科收治菌陰結(jié)核及肺外結(jié)核（肺結(jié)核符合中華結(jié)核病診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，淋巴結(jié)結(jié)核為病理證實，結(jié)核性胸膜炎、腰椎結(jié)核、結(jié)核球為治療隨訪后證實）患者49例（觀察組），平均年齡（47±19）歲，其中男27例，女22例。49例結(jié)核患者中，肺結(jié)核患者42例，結(jié)核性胸膜炎3例，腰椎結(jié)核1例，淋巴結(jié)結(jié)核2例，結(jié)核球1例。對照組47例，為經(jīng)相關(guān)檢查及治療后排除結(jié)核感染的患者，其中男28例，女19例，平均年齡（53±19）歲。47例患者中，其中肺炎34例，陳舊性結(jié)核2例，胸腔積液2例，腹腔積液1例，慢性支氣管炎1例，發(fā)熱1例，惡性腫瘤3例，慢性咳嗽1例，腮腺腫大1例，間質(zhì)性肺炎1例。兩組資料年齡、性別均無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 試劑與方法 T-SPOT.TB：T-SPOT.TB試劑盒（上海復(fù)星科技有限公司提供）。肝素抗凝管采集8 mL外周靜脈血，離心分離外周血單核細胞（PBMC）。于顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)，配置每100微升含有25萬細胞的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取出T-SPOT.TB試劑盒內(nèi)微板孔，陰性對照加入細胞培養(yǎng)液，陽性對照加入植物血凝素，另外兩孔分別加入抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP-10）各50 μL，然后每孔加入100 μL含有PCMC的上述細胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱37℃溫度孵育16～20 h，用pH值6.8～7.2的PBS液洗脫，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IFN-γ單克隆抗體50 μL，4℃孵育2 h，再用PBS液洗脫，每空加入顯色液50 μL。避光室溫靜置7 min，蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果，用放大鏡人工計數(shù)每空斑點數(shù)。陽性結(jié)果定義為：當(dāng)陰性對照孔點數(shù)為0～5時，測量孔點數(shù)減去對照孔點數(shù)≥6，當(dāng)陰性對照孔點數(shù)≥6時，測量孔點數(shù)≥兩倍對照孔點數(shù)[2]。

結(jié)核菌素試驗（PPD）：PPD（結(jié)核菌素純蛋白衍生物，四川成都生物技術(shù)公司生產(chǎn)，50 U/mL），以5 U注入左前臂內(nèi)側(cè)上中1/3交界處皮內(nèi)，使之形成皮丘，48～72 h觀察反應(yīng)，結(jié)果判斷以局部硬結(jié)直徑為依據(jù)，＜5 mm為陰性，5～9 mm為一般陽性反應(yīng)，10～19 mm為中度陽性反應(yīng)，≥20 mm或不足20 mm但有水皰或壞死為強陽性反應(yīng)[3]。

結(jié)核抗體：采用膠體金標(biāo)法，按試劑說明書操作。結(jié)核抗體檢測試劑由MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組中47例T-SPOT.TB檢測陽性，敏感性為95.9%，與PPD及結(jié)核抗體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。對照組中，2例T-SPOT.TB陽性，特異性為95.7%，與PPD及結(jié)核抗體比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 T-SPOT.TB試劑與PPD、結(jié)核抗體結(jié)果比較[n（%）]

3 討論

近年來，結(jié)核病的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。據(jù)估計2010年，全球新增結(jié)核病例共880萬例，約145萬患者死于結(jié)核感染[4]。我國是世界上僅次于印度的第二個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核感染率為44.5%，活動性結(jié)核患者450萬，每年死亡人數(shù)達13萬[5]。我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，2000年中國第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查資料[5]顯示，活動性肺結(jié)核患病率為367/10萬，菌陽肺結(jié)核患病率為160/10萬，涂陽肺結(jié)核患病率為122/10萬。而這一數(shù)據(jù)現(xiàn)仍呈上升趨勢。

結(jié)核菌的病原學(xué)檢查是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但其受標(biāo)本中細菌的數(shù)量影響大，常規(guī)培養(yǎng)需要時間長，且培養(yǎng)陽性率偏低，不利于肺結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)、診斷與治療。PPD試驗是目前篩查結(jié)核感染的主要防范，但其某些抗原成分與卡介苗及非結(jié)核性分枝桿菌抗原成分相同，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性的發(fā)生，且對于老年患者、免疫抑制、重癥、HIV感染及移植患者，存在假陰性[6-7]。此外，皮試操作和結(jié)果存在主觀性，從而進一步降低其檢查的準(zhǔn)確性。因此尋找快速、高效診斷活動性結(jié)核病的診斷方法尤為重要。T-SPOT.TB檢查是以特異性抗原為刺激源，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）診斷結(jié)核病的新方法，其具有較高的敏感性和特異性，且耗費時間較短，僅1 d。

Ma-hariras等[8]在1996年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中存在一段名為“RD 1”的基因序列。1999年，Behr等[9]應(yīng)用基因芯片技術(shù)將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H 37 Rv和BCG的全基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)129個只存在于結(jié)核分枝桿菌而BCG缺失的開放讀碼框，其被劃分為16個區(qū)域，后分別被命名為RD 1～RD 16，其中RD 1被證實為結(jié)核分枝桿菌所特有，在卡介苗菌株中均不存在。RD 1編碼產(chǎn)生兩種蛋白：CFP-10和ESAT-6，為結(jié)核分支桿菌特異性蛋白。結(jié)核感染人體后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性的記憶性T淋巴細胞，當(dāng)抗原再度刺激時，其能產(chǎn)生特異性的細胞因子IFN-γ。Lalvani等[10]以CFP-10和ESAT-6混合抗原多肽為刺激源刺激這些記憶性T淋巴細胞，使其分泌IFN-γ，檢測其細胞數(shù)，從而發(fā)現(xiàn)診斷結(jié)核感染的T-SPOT.TB這一新方法。

目前大量研究證實T-SPOT.TB檢測對于結(jié)核感染具有較高的敏感性和特異性。Pai等[11]的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性為90%。Dai等[12]最新的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性和特異性分別為88%和89%。而在免疫抑制患者中，T-SPOT.TB同樣顯示出較高的敏感性和特異性。Chapman等[13]的研究顯示，39例HIV陽性的結(jié)核患者中T-SPOT.TB的敏感性為90%，而PPD皮試僅為72%。Kim等[14]研究顯示，72例肺外結(jié)核患者的T-SPOT.TB和PPD的敏感性分別為94%和47%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。Liao等[15]的研究結(jié)果同樣顯示，T-SPOT.TB在肺外結(jié)核患者中有較高的敏感性和特異性，診斷的敏感性達到95%以上。國內(nèi)霍菲菲等[16]的資料顯示T-SPOT.TB在31例細菌學(xué)或組織學(xué)確診的肺外結(jié)核患者中的敏感性為93.5%。我們的結(jié)果與國內(nèi)外的報道相一致，T-SPOT.TB在診斷結(jié)核的敏感性和特異性分別為95.9%和95.7%，與PPD、結(jié)核抗體相比起具有更高的敏感性和特異性。

結(jié)核病很多沒有特異性的臨床表現(xiàn)，且PPD、結(jié)核抗體檢測、抗酸桿菌涂片菌均因其敏感性和特異性不夠，因此臨床常對結(jié)核病出現(xiàn)漏診、誤診。結(jié)核菌陽性率不高且培養(yǎng)時間較長，一般均在患者出院后才能出具報告，限制了其在臨床上的應(yīng)用。而T-SPOT.TB在診斷結(jié)核病方面有著較高的特異性和敏感性，且時間短，24 h內(nèi)即可出具結(jié)果，因此在輔助結(jié)核病的診斷方面有著較高的應(yīng)用價值，值得在臨床上推廣應(yīng)用，為患者早期診斷、早期治療提供幫助。

[1]Jasmer RM,Nahid p,Hopewell PC. Latent tuberculosis infection[J].N Engl J Med,2002,347(23):1860-1866.

[2]張瑛，孫亞蒙，徐欣暉等.結(jié)核感染T細胞斑點試驗在結(jié)核性疾病中的診斷價值[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）,2010,4(12):2431-2434.

[3]陳灝珠，林果為.實用內(nèi)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2010:600.

[4]World Health Organization.Global Tuberculosis Report 2011[M].Geneva:World Health Organization 2011：10.

[5]全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志，2002，24(2):65-66.

[6]Lee E,Holzman RS.Evolution and current use of the tuberculin test[J].Clin Infect Dis.2002.34(3):365-370.

[7]Andersen P,Munk ME,Pollock JM,et al.Specific immune-based diagnosis of tuberculosis[J].Lancet.2000,356(9235):1099-1104.

[8]Mahairas GG,Sabo PJ,Hickey MJ,et al.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis[J].J Bacteriol,1996,178(5):1274-1282.

[9]Behr MA,Wilson MA, Gill WP,et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J].Science,1999,284(5419):1520-1523.

[10]Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21 st century:new tools to tackle an old enemy[J].Chest,2007,131(6):1898-1906.

[11]Pai M, Zwerling A,Menzies D.Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosisinfection:an update[J].Ann Intern Med,2008,149(3):177-184.

[12]Dai Y,Feng Y,Xu R,et al.Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis:an updated meta-analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(11):3127-3137.

[13]Chapman AL,Munkanta M, Wilkinson KA,et al.Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positiveindividuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells[J].AIDS,2002,16(17):2285-2293.

[14]Kim SH,Song KH,Choi SJ,et al.Diagnostic usefulness of a T-cellbased assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients[J].Am J Med,2009,122(2):189-195.

[15]Liao CH,Chou CH,Lai CC,et al.Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease[J].J Infect,2009,59(6):402-408.

[16]霍霏霏，張麗帆，劉曉清.評價γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2009，31(4):449-452.