李 辛，賀成業(yè)，羅俊生，張鳳香

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心外科，遼寧錦州 121001

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族的一員。CaSR廣泛存在于血管系統(tǒng)中如腸系膜動(dòng)脈、基底動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腎動(dòng)脈皮下小動(dòng)脈和主動(dòng)脈等，并與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展有密切聯(lián)系[1]。但CaSR是否存在于頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中以及CaSR是否能對(duì)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移產(chǎn)生影響尚不得而知。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，探討CaSR在頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)情況，及其對(duì)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，為頸動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新思路。

材料和方法

1 材料 雄性SD大鼠，100~180 g(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；DMEM、胎牛血清(Hyclone公司)；CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)、CaSR抑制劑(NPS2390)(上海生工)；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；兔抗鼠CaSR抗體、兔抗鼠PCNA抗體、兔抗鼠MMP-9、MMP-2抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋公司)。

2 頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 選取100~180 g雄性SD大鼠，取頸動(dòng)脈血管中膜，用貼塊法分離、培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞。細(xì)胞在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，當(dāng)平滑肌細(xì)胞達(dá)到一定密度后，用0.25%胰蛋白酶消化，1∶2傳代，取3~6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)組及CaSR抑制劑(NPS2390)組。

3 RT-PCR檢測(cè)CaSR mRNA表達(dá) 培養(yǎng)48 h后用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)；CaSR：forward 5'TCCTGGTTGTCCTAGCTGTC 3'，reverse 5'CAGGCTT TACAAGTGATGAG 3'；β-actin：forward 5'GAAGG TGAAGGTCGGAGTC 3'，reverse 5'GAAGATGGTGAT GGGATTTC 3'。擴(kuò)增條件 ：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平滑肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板，24 h后，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)加藥，按正常對(duì)照組、CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)組及CaSR抑制劑(NPS2390)組，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入新鮮配制的濃度為5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DSMO，微量振蕩器上振蕩10 min，室溫孵育30 min后放入酶標(biāo)儀，以490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值(OD)。

5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將Matrigel與L-15培養(yǎng)基按1∶4稀釋，在Transwell上室中加入40 μl的Matrigel稀釋液，37 ℃中孵育12 h，使膠凝固。各組平滑肌細(xì)胞用含0.1% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度2×105/ml。取100 μl細(xì)胞加入上室，500 μl含血清培養(yǎng)基加入下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于CO2孵箱培養(yǎng)48 h后，取出小室，用棉簽蘸取PBS輕輕擦掉上膜細(xì)胞，小室以甲醇固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min；結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次，每次5 min后鏡下觀察，每個(gè)濾膜隨機(jī)取5個(gè)視野(100×)，取均值計(jì)數(shù)，照相分析。

6 Western blot檢測(cè)CaSR、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、MMP-9及MMP-2表達(dá) 收集各組細(xì)胞以冷PBS洗2次，以裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測(cè)定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠6%，分離膠10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h。分別與1∶600兔抗鼠CaSR和PCNA，1∶1 000兔抗鼠MMP-9及MMP-2抗體4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶500)，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以-x±s表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中CaSR的表達(dá)RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，CaSR抗體組可見(jiàn)明顯條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照組無(wú)任何條帶出現(xiàn)，說(shuō)明頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中有CaSR存在(見(jiàn)圖1、2)。

2 CaSR對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)組頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，而CaSR抑制劑(NPS2390)組頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外增殖能力明顯減弱(P＜0.05)，說(shuō)明CaSR的表達(dá)與頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)(見(jiàn)表1)。

3 CaSR對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 培養(yǎng)48 h后各組細(xì)胞體外遷移能力的檢測(cè)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CaSR抑制劑(NPS2390)組細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，而CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)組細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，說(shuō)明CaSR的表達(dá)變化可以影響頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)圖3。

4 CaSR對(duì)MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表達(dá)的的影響 與正常對(duì)照組相比，CaSR激動(dòng)劑(GdCl3)組MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而CaSR抑制劑(NPS2390)組MMP-9、MMP-2和PCNA蛋白表達(dá)減弱。見(jiàn)圖3。

表1 CaSR對(duì)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外增殖能力的影響(-x±s，n=6，OD值)

圖 1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定CaSR基因的表達(dá)(左)圖 2 免疫印跡方法鑒定CaSR蛋白的表達(dá)(右)1： CaSR抗體組； 2： 陰性對(duì)照組

圖 3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CaSR對(duì)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外侵襲能力的影響與正常對(duì)照組比較， CaSR表達(dá)的變化可以影響頸動(dòng)脈平滑肌的遷移能力A： 對(duì)照組； B： GdCl3組； C： NPS2390組(aP＜0.05，與正常對(duì)照組比較)

圖 4 免疫印跡方法鑒定MMP-9， MMP-2和PCNA蛋白的表達(dá)A: 對(duì)照組； B: GdCl3組； C: NPS2390組

討 論

頸動(dòng)脈粥樣硬化易形成頸動(dòng)脈狹窄，從而導(dǎo)致缺血性腦血管病的形成，因此有效預(yù)防頸動(dòng)脈粥樣硬化的形成可明顯降低缺血性腦血管病的發(fā)病率和死亡率。CaSR是由Brown等[2]于1993年從牛甲狀旁腺克隆出來(lái)的，隨后發(fā)現(xiàn)CaSR在很多組織細(xì)胞中均有表達(dá)如甲狀旁腺、腎臟、腦等。近年研究發(fā)現(xiàn)，在心肌組織中也存在CaSR，并且CaSR還參與了心肌缺血-再灌注損傷和心肌肥大等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3-5]；Ziegelstein等[6]證實(shí)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中存在CaSR的表達(dá)；Smajilovic等[7]不但證實(shí)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存在CaSR的表達(dá)，還證實(shí)CaSR可以影響主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。李光偉等[8-9]證實(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中有CaSR的表達(dá)，并且CaSR可導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。但頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中是否存在CaSR尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)RT-PCR和Western blot兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中是否存在CaSR的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CaSR抗體組有明顯條帶出現(xiàn)，說(shuō)明有CaSR的表達(dá)；而無(wú)CaSR抗體的陰性對(duì)照組無(wú)任何條帶出現(xiàn)，說(shuō)明無(wú)CaSR的表達(dá)，該研究結(jié)果表明頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中存在CaSR的表達(dá)。

大量研究已經(jīng)證實(shí)CaSR在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過(guò)程中起到十分重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CaSR與頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的關(guān)系。本研究首先通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比較，CaSR激動(dòng)劑組頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)，而CaSR抑制劑組頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外增殖能力明顯減弱。PCNA又被叫做周期蛋白，它參與DNA的合成過(guò)程，是判定細(xì)胞增殖活性的重要物質(zhì)，大量研究已經(jīng)證實(shí)PCNA的表達(dá)變化與細(xì)胞的增殖情況密不可分，兩者呈正相關(guān)關(guān)系[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CaSR激動(dòng)劑組PCNA蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而CaSR抑制劑組PCNA蛋白表達(dá)減弱。以上研究結(jié)果表明CaSR的表達(dá)變化能影響頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類高度保守的依賴于鋅離子和鈣離子內(nèi)切蛋白水解酶家族，MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)中的各種蛋白成分，能通過(guò)降解ECM導(dǎo)致細(xì)胞遷移[11]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和純化的MMPs至少有24種，其中MMP-2、MMP-9在細(xì)胞的遷移過(guò)程中起到極其重要的作用[12]。本研究Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比CaSR激動(dòng)劑組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，而CaSR抑制劑組均減弱；Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CaSR抑制劑組的細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，而CaSR激動(dòng)劑組則明顯增加；說(shuō)明頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的侵襲能力與CaSR的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)存在CaSR，并且能影響頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，這種影響可能是通過(guò)PCNA和MMP-2、MMP-9來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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