于立春，盛玉文，曲更慶，王慶軍，孫世寶

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧錦州 121001

近年研究發(fā)現(xiàn)，在多形性神經(jīng)膠質母細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、原發(fā)性前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌等人類腫瘤中，張力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10，PTEN)發(fā)生了不同程度的缺失和突變[1]。在各型白血病細胞中也發(fā)現(xiàn)PTEN有不同程度的突變和缺失[2]。目前人類最重要的抑癌基因是p53，在人類一半以上的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了p53基因的突變[3]。p53介導的細胞信號轉導途徑與細胞內其他信號轉導通路間的聯(lián)系十分復雜，近年研究發(fā)現(xiàn)，p53和PTEN在前列腺癌、子宮內膜癌存在相互關聯(lián)的作用[4]。本研究旨在探討共轉染野生型p53基因和PTEN基因對膀胱癌T24細胞凋亡的影響。

材料和方法

1 細胞和試劑 人膀胱腫瘤T24細胞株(中國科學院上海分院)；小牛血清(Hyclone公司)；抗生素潮霉素B(hygro-mycin B)、LipofectAMINETM2000、攜帶野生型p53基因、PTEN基因、重組質粒pVITR02-hp53、pVITR02-h PTEN和pVITR02-hp53-hPTEN的大腸埃希菌(Takara公司)；RNA提取試劑盒、TRIzol溶液以及RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；質粒抽提試劑盒(德國Qiagen公司)；反轉錄試劑盒(美國Promega公司)；鼠抗人PTEN、鼠抗人p53單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)。引物合成和DNA測序由武漢英騏生物技術有限公司完成。

2 細胞培養(yǎng)和基因轉染 T24細胞用含10%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液(加雙抗)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%)，每2~3 d換液1次，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底部80%左右時進行傳代，待傳至5~6代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。按產(chǎn)品說明書操作方法進行細胞轉染：將攜帶有重組質粒的大腸埃希菌進行擴增和培養(yǎng)，并提取質粒；實驗分空白質粒(pVITR02)轉染組(A組)、攜帶p53基因質粒(pVITR02-hp53)轉染組(B組)、攜帶PTEN基因質粒(pVITR02-hPTEN)轉染組(C組)、聯(lián)合攜帶p53-PTEN基因質粒(pVITR02-hp53-hPTEN)轉染組(D組)，每實驗組各取4 μg質粒，分別放入10 μl的LipofectAMINETM 2000中充分混勻，待靜置20 min分別加入1×106個T24細胞中，于6孔板中培養(yǎng)，待24 h后可按1∶10進行傳代，待36 h后加入濃度為200 μg/ml潮霉素B進行篩選，篩選后繼續(xù)培養(yǎng)擴增[5]。

3 RT-PCR法檢測目的基因的表達 抽提總的RNA：經(jīng)過篩選獲得的轉染細胞用0.25%胰酶消化后，收集細胞，洗滌細胞(用PBS液)2次，加入TRIzol溶液1 ml，吹打、振蕩10 min，最后加入氯仿0.2 ml，在2~8 ℃條件下離心5 min(12 000×g)，收集上清，加入異丙醇沉淀RNA 0.5 ml，最后溶于雙蒸水中(用焦碳酸二乙酯處理后)。取總RNA 1 μg，溶于20 μl反應體系中，加入隨機引物500 ng，RNAsin 20 U和Mo-MLV反轉錄酶200 U，70 ℃條件下反應10 min，40 ℃條件下靜置2 h，在-20 ℃保存cDNA產(chǎn)物以備用。用參考文獻[6]提供的方法進行p53基因引物設計，5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTG CCG-TAC-3'為上游引物，5'-CTATGTCGAAAAGT GTITCTGTCATC-3'為下游引物。擴增條件：94 ℃(預變性)3 min， 94 ℃(變性)30 s、 56 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)30 s，共30個循環(huán)。參照GenBank提供的PTEN基因序列，5'-CAGCCAAGTCTGTGACTT GCCG-TAC-3'為上游引物，5'-CCGCTCGAGCAGT CGCTGCAACCATCCA-3'為下游引物，擴增條件：94 ℃(預變性)5 min，94 ℃(變性)30 s，60 ℃(退火)30 s，72 ℃(延伸)1 min，循環(huán)30次。待目的片段的擴增體系達到總體積為25 μl時，加入Taq酶1.0 U、引物82.5 ng和cDNA 2 μl。取10μl擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色后，觀察電泳結果(在紫外燈下)，攝片記錄。在熒光顯微鏡下觀察各組(空載體組、p53基因轉染組、PTEN基因轉染組和p53基因聯(lián)合PTEN基因共轉染組)綠色熒光蛋白在細胞內的表達情況。

4 細胞集落形成實驗 將處于對數(shù)生長期的4組T24細胞(轉染后)即A組、B組、C組和D組，接種于24孔板中(按照每孔300個/ml的細胞密度)，每組設5個平行孔。培養(yǎng)7 d(在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的飽和濕度環(huán)境)，棄去上清液，洗滌細胞2次(用PBS)，加入甲醇溶液5 ml固定15 min后，再加入吉姆薩染色液200 μl染色細胞20 min，用流水沖洗去除染色液，待干燥后，計數(shù)＞1 mm視野的集落數(shù)目(在光學顯微鏡下進行)。

5 Western blotting檢測p53、PTEN蛋白表達 分別收集4組細胞，提取每組細胞的蛋白，以牛血清蛋白為標準品，測定四組及標準品的蛋白含量。用質量分數(shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離， 然后轉至硝酸纖維膜(或PVDF膜)上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，并洗膜，加入按1∶500倍稀釋的鼠抗人PTEN單克隆抗體，在4 ℃條件下過夜。洗膜后加入二抗(用辣根過氧化物酶標記)，作用1 h(室溫)，洗膜后用ECL顯色，并在暗室曝光，用顯影定影后掃描分析，用蛋白表達強度表示其結果。

6 Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測細胞凋亡率分別取4組處于對數(shù)生長期的T24細胞，分別進行消化、離心，并收集制成細胞懸液，調整細胞密度為1×106/ml，取細胞懸液100 μl，分別加入用FITC標記的Annexin V 5 ml和碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 ml，及時用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用-x±s表示，采用單因素方差分析法，兩兩比較用q檢驗，方差不齊用Dunnett-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 基因轉染后p53和PTEN mRNA的表達 RTPCR檢測結果顯示，B組和C組中分別有p53和PTEN mRNA的表達，D組中p53和PTEN mRNA同時存在。見圖1。

圖 l RT-PCR檢測p53和PTEN mRNA在T24細胞中的表達A： 實驗分空白質粒(pVITR02)轉染組; B: 攜帶p53基因質粒(pVITR02-hp53)轉染組； C：攜帶PTEN基因質粒(pVITR02-hPTEN)轉染組； D： 聯(lián)合攜帶p53-PTEN基因質粒(pVITR02-hp53-hPTEN)轉染組

2 熒光顯微鏡下重組質粒的表達 在熒光顯微鏡下觀察轉染后的B、C、D組細胞(在轉染后48 h效果最好)，可見綠色熒光主要集中在細胞質中，即綠色熒光蛋白表達成功(圖2)。A組未見熒光蛋白表達，B、C、D組細胞的熒光蛋白表達無明顯差別。見圖2。

3 細胞集落形成實驗 p53和(或)PTEN經(jīng)過B組、C組以及D組共轉染后，集落數(shù)在各組T24細胞中均有減少，B組、C組和D組與A組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

4 T24細胞中p53、PTEN蛋白的表達 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)圖3中p53蛋白表達提示B、D組與C、A組相比明顯增加(圖3) (P＜0.05)，且D組高于B組(P＜0.05)。PTEN蛋白的表達，C、D組與B、A組相比明顯增加(圖4) (P＜0.05)，且D組高于C組(P＜0.05)。見表2。

5 Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測細胞凋亡率Annexin V-FITC V/PI雙染法檢測結果顯示：B組、C組和D組明顯高于A組(P＜0.05)，且D組明顯高于B組和C組(P＜0.05）見圖5、表3。

圖 3 Western blotting檢測p53基因蛋白表達情況

圖 4 Western blotting檢測PTEN基因蛋白表達情況

表l p53和PTEN基因轉染對T24細胞集落形成數(shù)的影響(-x±s，n=5)

表2 不同組別中p53、PTEN蛋白的表達(-x±s，n=5)

表3 p53和PTEN基因轉染對T24細胞凋亡率(-x±s，n=5)

討 論

基因治療已經(jīng)成為腫瘤治療的新探索。其中抑癌基因治療是腫瘤基因治療的方法之一，在正常細胞中抑癌基因失活、突變和(或)癌基因的過度激活等都有可能引起腫瘤的發(fā)生，基于這一點將正常功能的野生型抑癌基因轉染到腫瘤細胞中，并在腫瘤細胞表達，恢復細胞正常的生長表型，從而達到抑制腫瘤的作用。人類p53基因是由11個外顯子和10個內含子組成，位于17p13.1，長度約20 kb，是目前研究最廣泛和最深入的一種抑癌基因，具有多種生物學功能：能夠阻滯細胞有絲分裂的周期；其蛋白的表達能夠抑制腫瘤血管的形成；能夠促進細胞的凋亡[7-9]。PTEN基因有9個外顯子和8個內含子，位于10q23.3，由200 kb組成，是到目前為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因[10]。PTEN編碼的是一種多功能蛋白質，同時具有蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性，通過干擾PI3K/AKT的信號傳導，使細胞在細胞周期G期受到阻滯[11]。其生物學功能主要是：使細胞遷移、鋪展、局部黏附和增殖受到抑制；當其等位基因丟失時會引起皮膚、胃腸道、前列腺的腫瘤，這與PTEN基因參與胚胎的正常發(fā)育有關，最近研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因的異常表達可能會導致白血病的發(fā)生；PTEN蛋白表達能抑制腫瘤血管形成[12]。在人類自發(fā)腫瘤和遺傳病中，p53與PTEN有較高的突變率，但兩種基因同時發(fā)生突變的發(fā)生率較小[13-15]。在制作鼠的前列腺癌實驗中得出這樣的結論：p53與PTEN在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展方面存在互補作用，這種相互作用具有深刻的分子機制[16]。

圖 5 p53和PTEN基因轉染對T24細胞凋亡率的影響

Ogawara等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN使AKT的活化受到抑制，從而MDM2蛋白Serl66不能被磷酸化活化，隨后在細胞質中被降解，抑制腫瘤的發(fā)生。Chang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN通過作用于啟動子MDM2從而導致MDM2基因轉錄被抑制，MDM2活性受到抑制，增強了抑瘤功能。在我們檢測細胞凋亡率時也發(fā)現(xiàn)：p53基因聯(lián)合PTEN基因共轉染組細胞的凋亡率明顯高于空染體組和兩個單染組。

Tang和Eng[19]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN和p53形成的復合物可以增強p53轉錄及其蛋白的穩(wěn)定性[19-22]。這和Freeman等[20]研究發(fā)現(xiàn)類似，當PTEN和p53結合后，從而穩(wěn)定了P53蛋白；也使p53的DNA結合能力增強，相應的p53的轉錄活性也增強。本實驗的Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)共轉染組(pVITR02-hp53-hPTEN轉染組)蛋白表達強度明顯增強于單轉組(pVITR02-hp53、pVITR02-hPTEN)和空轉染組，這與兩者的相互作用和維持正常細胞基因組的穩(wěn)定性、凋亡功能和正常細胞周期有關。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當敲除p53基因時，磷酸化PTEN蛋白表達水平明顯降低，p53可以激活PTEN轉錄，通過直接結合PTEN上游序列，抑制了細胞PI3KAkt信號傳導。這點我們用Western blotting檢測可以得到證實，即共轉染組蛋白表達顯著高于單用PTEN組。

本研究結果顯示，p53和PTEN基因均可誘導膀胱癌細胞T24的凋亡，共轉染組較單基因轉染組可更顯著地誘導細胞凋亡。說明這2種基因在膀胱癌細胞T24細胞凋亡方面具有協(xié)同增強作用，其作用機制可能與2種基因在細胞周期監(jiān)控和細胞凋亡上相互調節(jié)相互協(xié)同等方面有著重要作用。這種相互作用對細胞周期和凋亡產(chǎn)生較大影響。

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