高蜜陽，張榮明，熊亮，申錦帆，劉暢

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 燒傷整形科，遼寧 錦州121000）

瘢痕疙瘩是由于傷口、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)切口或疾病等導(dǎo)致瘢痕形成，主要與成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān)[1]。瘢痕疙瘩的臨床表現(xiàn)主要是高出皮膚的瘢痕組織生長，通常伴有瘙癢和疼痛。有研究顯示瘢痕疙瘩的形成與基因調(diào)控、炎癥因子、細(xì)胞因子和免疫因素等密切相關(guān)[2]。由于瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制和調(diào)控機(jī)制尚不清楚，瘢痕疙瘩的治療仍未取得突破性進(jìn)展。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是非編碼RNA的亞類，其長度超過200 nt，且具有比編碼RNA 更強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性。lncRNA 在不同的細(xì)胞、組織及其不同的發(fā)育階段中表達(dá)均不同，并參與各種疾病的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)在細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡和代謝等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究顯示大量lncRNAs 在瘢痕疙瘩中存在異常表達(dá)，其中l(wèi)ncRNA AC073257.2 能夠調(diào)控GLI2基因，參與成纖維細(xì)胞的生長、增殖；lncRNA HNF1A-AS1 能夠調(diào)控HNF1A基因，參與瘢痕疙瘩的形成[4]。有研究顯示被轉(zhuǎn)化生長因子b 激活的長鏈非編碼RNA（lncRNA-ATB）在腫瘤、外周血管疾病、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、免疫性等疾病中發(fā)揮著重要作用[5-7]。然而ATB 在瘢痕疙瘩中的作用及機(jī)制尚未完全闡明。因此本研究采用RT-PCR 檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中ATB 的表達(dá)水平，并進(jìn)一步深入探討ATB 調(diào)控miR-200c/DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B 通路在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，證實(shí)ATB/miR-200c/DNMT3B 軸對瘢痕疙瘩形成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2017年12月—2018年7月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形科接受瘢痕疙瘩治療的30 例患者。其中，男性19 例，女性11 例；平均年齡（32.7±10.1）歲；在手術(shù)前均未接受藥物治療、放射治療、化學(xué)治療、激光治療等。排除腫瘤、免疫性疾病及嚴(yán)重的肝腎功能不全患者。術(shù)中切除瘢痕疙瘩和少量周圍正常皮膚組織，標(biāo)本保存于液氮中用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)分為瘢痕疙瘩組和正常皮膚組，以及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組與正常成纖維細(xì)胞組?；颊呔炇鹬橥鈺?/p>

1.2 主要試劑

DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8 試劑盒購自大連碧云天生物技術(shù)有限公司，磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購自上海思吉生物制品有限公司， RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000 購自日本TaKaRa 公司，Trizol Reagent 和SYBR Green 購自美國Promega 公司，miRNeasy Mini Kit 購自德國Qiagen 公司，TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，兔抗人DNMT3B、周期素依賴性激酶6（CDK6）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和β-actin 抗體購自美國Abcam 公司，HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自美國CST 公司。sh-ATB、sh-DNMT3B、miR-NC、miR-200c mimics 和miR-200c inhibitors 由中國上海Genepharm 公司合成。通過PCR 擴(kuò)增野生型（o/e-ATB） 或突變體（o/e-NC）ATB 片段，并亞克隆到pcDNA3.1 載體，pcDNA3.1載體購自美國Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用Lipofectamine 2000 按試劑盒說明書轉(zhuǎn)染sh-ATB、 o/e-ATB、 miR-200c mimics、 miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B，轉(zhuǎn)染24 h 后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)根據(jù)不同轉(zhuǎn)染方式分為：sh-NC 組、sh-ATB組、o/e-NC 組、o/e-ATB 組、miR-NC 組、miR-200c mimics 組、miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組。

1.3.2 qRT-PCR采用miRNeasy Mini Kit 提取miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒檢測miR-200c 的相對表達(dá)量，并使用Applied Biosystem 7500 進(jìn)行qRT-PCR，U6 作為內(nèi)參。采用Trizol 提取組織和細(xì)胞中總RNA，使用NanoDrop 1000 分光光度計(jì)測定RNA 的濃度，使用PrimeScriptTMqRT-PCR試劑盒從總RNA 合成第一鏈互補(bǔ)DNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR，以βactin 作為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

1.3.3 細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞，以2×104個(gè)密度接種到96 孔培養(yǎng)板中，各組細(xì)胞分別培養(yǎng)0 d、1 d、2 d 和3 d 后，加入10 μl 的CCK-8 溶液，在37℃下再孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值。

1.3.4 細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞，以2×105個(gè)密度接種到6 孔培養(yǎng)板中，以2×104個(gè)密度接種到96 孔培養(yǎng)板中，加入10 μl Annexin VFITC 和5μl 碘化丙啶染色液（0.25 mg/ml），輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.5 雙熒光素酶將野生型ATB（ATB-WT）、突變型ATB（ATB-MUT）、野生型DNMT3B（DNMT3B-WT）或突變型DNMT3B （DNMT3B-MUT）克隆到pmirGLO 質(zhì)粒受體中，同時(shí)將miR-200c mimics 或miR-NC 導(dǎo)入293 細(xì)胞中，共培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量雙熒光素活性。

1.3.6 Western blotting轉(zhuǎn)染后24 h 收集各組細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，使用10% SDS-PAGE 凝膠分離等量（50 μg）蛋白質(zhì)樣品，110 V 電泳，250 mA 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉37℃封閉2 h。分別加入DNMT3B、CDK6、Caspase-3 和β-actin 一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，30 min/次，ECL顯影。并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較用配對t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATB 在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

瘢痕疙瘩組與正常皮膚組ATB 相對表達(dá)量分別為（2.96±1.07）和（1.11±0.49），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.561，P=0.000），瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組與正常成纖維細(xì)胞組ATB 相對表達(dá)量分別為（2.37±0.26）和（1.07±0.12），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.814，P=0.001），瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞組較正常成纖維細(xì)胞組高。sh-NC 組與sh-ATB 組ATB 的相對表達(dá)量分別為（0.44±0.10）和（1.01±0.15），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.476，P=0.005），sh-ATB 組 較sh-NC 組 高。o/e-NC 組與o/e-ATB 組ATB 的相對表達(dá)量分別為（1.01±0.06）和（1.97±0.21），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.686，P=0.002），o/e-ATB 組較o/e-NC 組高。

2.2 低表達(dá)ATB對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響

sh-ATB 組與sh-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=180.102，P=0.000）；②sh-ATB 組與sh-NC 組的OD450 值比較有差異（F=61.130，P=0.000），sh-ATB 組較sh-NC組低；③sh-ATB組與sh-NC組的OD450 值變化趨勢比較有差異（F=10.612，P=0.000）。同時(shí)sh-NC 組與sh-ATB 組CDK6 的相對表達(dá)量分別為（0.96±0.12）和（0.57±0.08），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.678，P=0.010），sh-ATB 組較sh-NC 組低（見圖1）。進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡情況，sh-NC 組與sh-ATB 組細(xì)胞的凋亡率分別為（6.97±1.43）%和（14.00±1.37）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.142，P=0.004），sh-ATB組較sh-NC 組高（見圖2）。sh-NC 組與sh-ATB 組Caspase-3 的相對表達(dá)量分別為（0.99±0.12） 和（1.74±0.10），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.839，P=0.004），sh-ATB組較sh-NC組高（見圖3）。見表1。

圖1 sh-NC組與sh-ATB組CDK6相對表達(dá)量比較

圖2 低表達(dá)ATB對成纖維細(xì)胞凋亡的影響

圖3 低表達(dá)ATB對凋亡相關(guān)分子Caspase-3表達(dá)的影響

表1 sh-ATB組與sh-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 （x±s）

2.3 ATB靶向結(jié)合miR-200c

miR-NC 組ATB-WT 和ATB-MUT 雙熒光素酶活性分別為（1.15±0.08） 和（1.07±0.09），miR-200c mimics 組分別為（0.47±0.04） 和（1.10±0.04）。兩組ATB-WT 雙熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.083，P=0.000），兩組ATB-MUT雙熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.469，P=0.664）。o/e-ATB 組miR-200c 相對表達(dá)量為（0.45±0.06），o/e-NC 組為（1.02±0.12），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.190，P=0.002），o/e-ATB 組低于o/e-NC 組。sh-NC 組與sh-ATB 組miR-200c 相對表達(dá)量分別為（0.97±0.12） 和（1.47±0.12），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.977，P=0.008），sh-ATB 組高于sh-NC 組。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組miR-200c 相對表達(dá)量分別為（0.66±0.20）和（1.17±0.39），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.461，P=0.000），瘢痕疙瘩組低于正常皮膚組。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析，ATB 與miR-200c 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-3.429，P=0.000）（見圖4）。miR-NC 組miR-200c 相對表達(dá)量為（1.01±0.13），miR-200c mimics 組相對表達(dá) 量為（1.54±0.10）， miR-200c inhibitors 組為（0.45±0.08），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=76.010，P=0.000），成纖維細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后能夠促進(jìn)miR-200c 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 后能夠抑制miR-200c 的表達(dá)。

圖4 ATB與miR-200c在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.4 過表達(dá)miR-200c 對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-200c mimics 組和miR-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析顯示：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=331.764，P=0.000）；②兩組的OD450值比較有差異（F=155.169，P=0.000），miR-200c mimics 組較miR-NC 組低；③兩組的OD450 值變化趨勢比較有差異（F=17.397，P=0.000）。miR-NC組與miR-200c mimics 組CDK6 的相對表達(dá)量分別為（1.00±0.16）和（0.45±0.07），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.529，P=0.005），miR-200c mimics組較miR-NC 組低（見圖5）。miR-NC 組與miR-200c mimics 組細(xì)胞凋亡率分別為（7.40±0.28）%和（16.53±1.14）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.252，P=0.001）（見圖6），miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。miR-NC 組 與miR-200c mimics 組Caspase-3 的相對表達(dá)量分別為（1.02±0.22） 和（1.63±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.467，P=0.011）（見圖7），miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。見表2。

圖5 過表達(dá)miR-200c對增殖相關(guān)分子CDK6表達(dá)的影響

圖6 過表達(dá)miR-200c對成纖維細(xì)胞凋亡的影響

圖7 過表達(dá)miR-200c對凋亡相關(guān)分子Caspase-3表達(dá)的影響

表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 （±s）

表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組0.56±0.03 0.56±0.01 1.16±0.07 0.65±0.10 1.71±0.10 1.15±0.12 2.22±0.17 1.64±0.14

2.5 miR-200c能夠靶向結(jié)合DNMT3B

miR-200c mimics 組DNMT3B-WT 和DNMT3BMUT 熒光素酶活性分別為（0.58±0.04） 和（0.97±0.08），miR-NC 組分別為（0.98±0.07） 和（1.04±0.07）。兩組DNMT3B-WT 熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.094，P=0.001），轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后雙熒光素活性下降。兩組DNMT3B-MUT 熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.090，P=0.337）。miR-NC 組與miR-200c mimics 組DNMT3B 蛋白相對表達(dá)量分別為（1.02±0.05）和（0.51±0.04），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.796，P=0.000），miR-200c mimics 組較miR-NC 組低（見圖8）。miR-NC 組 與miR-200c inhibitors 組DNMT3B 蛋白相對表達(dá)量分別為（1.04±0.07）和（1.47±0.11），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.712，P=0.005），miR-200c inhibitors 組 較miRNC 組高。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組DNMT3B 相對表達(dá)量分別為（2.28±0.70）和（1.03±0.30），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.025，P=0.000），瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。經(jīng)Spearman 分析，miR-200c與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-2.011，P=0.001）（見圖9），ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.829，P=0.002）（見圖10）。

圖8 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染染miR-NC、miR-200c mimics和miR-200c inhibitors后DNMT3B的表達(dá)水平

圖9 miR-200c與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

圖10 ATB與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.6 ATB 調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞細(xì)胞的增殖和凋亡

共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-NC組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=192.560，P=0.000）；②兩組OD450 值比較無差異（F=4.339，P=0.054）；③兩組OD450 值變化趨勢比較無差異（F=1.024，P=0.409）。共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-ATB 組成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=138.352，P=0.000）；②兩組OD450值比較有差異（F=27.567，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=4.235，P=0.022）。sh-NC 組與共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組細(xì)胞凋亡率分別為（6.97±1.43）%和（7.60±1.35）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.559，P=0.606）。見表3。

共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組與o/e-ATB 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=271.965，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=42.868，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=7.459，P=0.002）。共轉(zhuǎn)染o/e-ATB 和miR-200c inhibitors 組和o/e-ATB 組細(xì)胞凋亡率分別為（2.37±0.85）%和（4.35±0.60）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.302，P=0.030），o/e-ATB 組較共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組高。見表4。

共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-NC 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=177.080，P=0.000）；②兩組OD450 值比較無差異（F=0.002，P=0.964）；③兩組OD450 值變化趨勢比較無差異（F=2.661，P=0.083）。共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-200c inhibitors 組成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=171.475，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=45.448，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=6.883，P=0.003）。miR-NC 組與共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組細(xì)胞凋亡率分別為（7.40±1.28）%和（6.63±0.91）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.848，P=0.444）。見表5。

共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組與miR-200c mimics 組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞OD450 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD450 值比較有差異（F=83.287，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=14.702，P=0.002）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=5.401，P=0.009）。共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組 與miR-200c mimics 組 細(xì)胞 凋 亡 率分別為（21.17±1.41）% 和（16.53±1.14）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.440，P=0.011），共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組較miR-200c mimics 組高。這提示ATB 能夠通過調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡。見表6。

表3 共轉(zhuǎn)染sh-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

表3 共轉(zhuǎn)染sh-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d sh-NC組sh-ATB組共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors組0.57±0.05 0.57±0.02 0.59±0.03 0.93±0.15 0.73±0.13 0.88±0.06 1.63±0.13 1.15±0.15 1.45±0.13 2.06±0.17 1.48±0.13 1.90±0.09

表4 共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

表4 共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d o/e-NC組o/e-ATB組共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組0.58±0.04 0.56±0.03 0.57±0.03 0.98±0.18 1.29±0.19 1.65±0.16 1.58±0.10 2.06±0.17 2.45±0.16 1.97±0.10 2.44±0.17 3.25±0.16

表5 共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

表5 共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c inhibitors組共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B組0.56±0.03 0.58±0.01 0.57±0.02 1.11±0.14 1.62±0.14 1.20±0.14 1.71±0.10 2.31±0.17 1.46±0.13 2.22±0.17 2.87±0.27 2.38±0.22

表6 共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

表6 共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B組0.57±0.03 0.56±0.01 0.57±0.02 1.16±0.07 0.65±0.10 0.64±0.13 1.71±0.10 1.15±0.13 0.89±0.09 2.22±0.17 1.64±0.14 1.23±0.14

3 討論

在瘢痕疙瘩的研究中，越來越多的研究開始轉(zhuǎn)向LncRNAs 和miRNAs 對瘢痕疙瘩的調(diào)控作用[8]。目前采用基因芯片證實(shí)在瘢痕疙瘩存在大量異常表達(dá)的LncRNAs 和miRNAs，其中有研究顯示在瘢痕疙瘩中有1 731 種lncRNAs 表達(dá)上調(diào)，782 種lncRNAs 表達(dá)下調(diào)[9]。LncRNAs 能夠通過多種途徑參與疾病的調(diào)控，其中最常見的是ceRNA 機(jī)制，即LncRNAs 靶向結(jié)合miRNAs，進(jìn)而調(diào)控下游分子的表達(dá)。miRNAs 是一類非編碼的小RNA，長度只有20～24 nt，在生物體基因組中普遍存在。目前研究證實(shí)miRNAs 只占所有RNA 的1.0%左右，但能夠調(diào)控機(jī)體30%～50%基因表達(dá)[10]。miRNAs 通過靶向調(diào)控靶mRNA，參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)行為。隨著對miRNAs 研究的深入，越來越多的證據(jù)表明miRNAs參與瘢痕疙瘩的形成[11]。然而關(guān)于LncRNAs 調(diào)控miRNAs 在瘢痕疙瘩中的研究尚少。

在本研究中采用qRT-PCR 檢測瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ATB 相對表達(dá)量，結(jié)果顯示ATB 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚，同時(shí)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞中ATB的表達(dá)水平明顯高于正常成纖維細(xì)胞。這提示ATB在瘢痕疙瘩中存在明顯異常表達(dá)。在進(jìn)一步的研究中采用shRNA 干擾技術(shù)在成纖維細(xì)胞中低表達(dá)ATB，結(jié)果顯示低表達(dá)ATB 能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)分子CDK6，上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3 的表達(dá)水平。這提示ATB 參與瘢痕疙瘩的形成。然而其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

有研究顯示miR-152-3p、miR-21、miR-200c和miR-203 在瘢痕疙瘩中均存在異常表達(dá)，并參與瘢痕疙瘩的形成[12-14]。同時(shí)研究顯示LncRNA HOXA11-AS 能夠靶向結(jié)合miR-124-3p 而抑制Smad5 的表達(dá)，參與瘢痕疙瘩細(xì)胞外基質(zhì)的形成[15]。最近有研究顯示，ATB 能夠通過調(diào)控miR-200c 參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[16]。在本研究中，雙熒光素酶結(jié)果顯示ATB 能夠靶向結(jié)合miR-200c，同時(shí)在成纖維細(xì)胞細(xì)胞中轉(zhuǎn)染o/e-ATB 后能夠明顯抑制miR-200c 的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)染sh-ATB 后能夠明顯促進(jìn)miR-200c 的表達(dá)水平，這說明在成纖維細(xì)胞中ATB 能夠靶向抑制miR-200c。在進(jìn)一步的人體瘢痕疙瘩組織中也正證實(shí)ATB 與miR-200c 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

為證實(shí)miR-200c 在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮的作用，采用miR-200c mimics 過表達(dá)miR-200c 后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)分子CDK6 和上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3 的表達(dá)水平。這一結(jié)果與低表達(dá)ATB 對成纖維細(xì)胞的作用相似，更進(jìn)一步提示ATB 能夠靶向結(jié)合miR-200c 而抑制miR-200c 的表達(dá)水平。

DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)中一種重要的修飾方式，主要是通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, DNMT）來催化和維持起作用[17]。DNMT家族成員在生命的各種活動中均發(fā)揮重要作用，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和DNMT3B，后兩者主要在哺乳動物中發(fā)揮作用[18]。DNMT3B 是從頭DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以不需要甲基化的DNA 作模板，即可完成非甲基化的DNA 的甲基化修飾，研究顯示DNMT3B 參與了腫瘤、血管性疾病和免疫性疾病等[19]。同時(shí)也有研究顯示DNMT3B 在瘢痕組織中的表達(dá)水平明顯升高[20]。在本研究中雙熒光素酶結(jié)果顯示miR-200c 能夠靶向結(jié)合DNMT3B，同時(shí)在成纖維細(xì)胞細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 后能夠明顯抑制DNMT3B 蛋白的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 后能夠明顯促進(jìn)DNMT3B 蛋白的表達(dá)。 這進(jìn)一步提示miR-200c 能夠靶向結(jié)合DNMT3B，進(jìn)而抑制DNMT3B 的表達(dá)。同時(shí)miR-200c 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，這提示ATB 可能通過靶向抑制miR-200c，進(jìn)而促進(jìn)DNMT3B 的表達(dá)，最后參與成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡。

在進(jìn)一步的回復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)中，已證實(shí)lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的作用。結(jié)果顯示在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染sh-ATB 和miR-200c inhibitors 能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染sh-ATB 對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，共轉(zhuǎn)染o/e-ATB和miR-200c inhibitors 能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染o/e-ATB 對細(xì)胞增殖和凋亡的影響；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B 能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors 對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 和sh-DNMT3B能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-200c mimics 對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。這進(jìn)一步證實(shí)ATB 能夠通過調(diào)控miR-200c/ DNMT3B 通路參與成纖維細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，ATB 在瘢痕疙瘩組織中高表達(dá)，低表達(dá)ATB 能夠通過調(diào)控miR-200c/DNMT3B 通路，抑制成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用。ATB 可能成為瘢痕疙瘩治療的新靶點(diǎn)。