蘭 天，常秀亭，勾紅菊，吳 騰，王麗京△，黃河清▲

（1.廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cells，GMC）的增生、肥大及其功能改變?nèi)绶置诩毎饣|(zhì)是糖尿病腎病腎小球硬化的主 要 病 理 基 礎(chǔ)［1－2］。 磷 酸 鞘 氨 醇 （sphingosine 1－phosphate，S1P）是細胞膜組成成分磷脂的代謝產(chǎn)物，鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）催化S1P生成，促進細胞存活和保護細胞免受凋亡損傷［3－5］。研究發(fā)現(xiàn)，用糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）處理 GMC后，發(fā)現(xiàn)SphK1活性與S1P增高［6］。鑒于此，本研究采用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷大鼠模型觀察其腎組織SphK1－S1P信號通路的變化，為探尋將SphK1－S1P信號通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠（175～200g）購自中山大學(xué)實驗動物中心，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。采用新鮮配制的鏈尿佐菌素（STZ）60mg／kg體質(zhì)量溶于10mmol／L枸櫞酸緩沖液，pH 4.5（Sigma公司），大鼠尾靜脈注射復(fù)制糖尿病模型。正常對照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。采用One－Touch Ultra血糖儀（Johnson ＆Johnson Co.，Milpitas，California，USA）檢測血糖。造模后72h測量空腹血糖，大鼠血糖濃度大于16.7mmol／L納入糖尿病模型標準。糖尿病模型組與正常對照組各8只大鼠，大鼠每周稱量體質(zhì)量，每月測量血糖。實驗周期為12周。

1.2 生化分析 在實驗結(jié)束時，稱大鼠體質(zhì)量，置于代謝籠收集24h的尿液。血肌酐和24h尿蛋白經(jīng)中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科分析。大鼠處死后，分離腎臟，稱重并一部分固定在4%的多聚甲醛溶液；另一部分液氮速凍后置于－80℃凍存。腎臟肥大指數(shù)用腎重體質(zhì)量比表示。

1.3 腎臟形態(tài)學(xué)研究 在實驗結(jié)束、收取完尿液、血液與標本，大鼠處死后、用PBS全身灌流，分離腎臟，然后在4%的多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋。切片4μm厚度進行PAS染色。采用光鏡分析腎小球硬化程度和系膜區(qū)擴展程度。用蘇木精染核后，每個切片觀察50個腎小球。通過計算腎小球橫切面來評價腎小球肥大。切片采用Olympus數(shù)字光學(xué)顯微鏡進行拍照并轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖片格式。腎小球橫切面采用圖像分析軟件Image Pro.Plus（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD，USA）進行分析。每個動物分析50個腎小球，計算均值并進行統(tǒng)計分析。

1.4 定量Real－time PCR檢測mRNA水平 按照TRIzolTM（Invitrogen）說明書提取組織或細胞的總RNA?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄后，采用Bio－Rad iCycler Iq system進行定量real－time PCR。用于擴增的 引物序 列如下：SphK1（forward primer，5′－GGC AGC GAA CCC CAC CAC TC－3′；reverse primer，5′－GCG GGT GTC TGG TGA CTG GC－3′）；SphK2（forward primer，5′－CAC CTG TGC TGG GTG CGG AG－3′；reverse primer，5′－GGC AGC CCA GGC TGA AGT GG－3′）and GAPDH（forward primer，5′－AGG AGT AAG AAA CCC TGG AC－3′；reverse primer，5′－CTG GGA TGG AAT TGT GAG－3′）。mRNA水平采用GAPDH校正。熒光強度的平均閾值用于分析其mRNA水平。mRNA的相對量采用ΔΔCt進行計算。

1.5 Western blot檢測蛋白表達 腎臟組織勻漿經(jīng)裂解提取蛋白后，經(jīng)SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1h，將一抗、二抗孵育后，采用增強型的化學(xué)發(fā)光液檢測條帶信號。膜重孵鼠單抗α－tubulin作為內(nèi)參對照。采用Quantity－One軟件進行灰度分析。

1.6 鞘氨醇激酶活性測定 參考作者報道的方法進行SphK1活性的液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）法檢測［7］。30μg總蛋白液用于酶活性測定，反應(yīng)采用2.5μL 200μM C17－Sph（溶于5%Triton X－100）和2.5μL 20mM ATP含 MgCl2（200mM），總體積50μL。37℃水浴反應(yīng)20min后，用5μL 1MHCl和200μL氯仿∶甲醇∶濃鹽酸（100∶200∶1，v／v）終止反應(yīng)。然后加入10ng S1P作為內(nèi)標。劇烈渦旋后，加入60μL氯仿和60μL 2MKCl，4℃，12 000g離心5min。下層的氯仿相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管，室溫真空干燥60min。揮干的殘渣用100μL流動相（methanol：0.1%formic acid＝95∶5，v／v）重懸，然后劇烈渦旋1min。終溶液進樣10μL進行液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）（ThermoFinnigan）分析。

1.7 S1P含量測定 參照作者前期報道的方法［8］，用LCMS／MS法進行S1P定量分析。稱量冰凍的腎臟組織樣本20 mg，用400μL的蒸餾水進行電動勻漿。細胞則用PBS刮取下來，離心，并用100μL的PBS重懸，采用BCA法進行蛋白定量。S1P及相應(yīng)的化合物采用甲醇沉淀抽提。混合液渦旋10 min后，4℃，12 000r／min離心5min，然后上清液轉(zhuǎn)移至一干凈的玻璃自動上樣瓶中。每次進樣10μL進行LC－MS／MS分析。

2 結(jié) 果

2.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷 如表1所示，實驗12周結(jié)束時，與正常對照組比較，糖尿病組大鼠的空腹血糖值顯著升高（P＜0.01），糖尿病大鼠的腎重／體質(zhì)量比與正常對照組比較顯著增加（P＜0.05）。實驗結(jié)束時糖尿病大鼠的24h尿蛋白明顯增高（P＜0.05）。糖尿病大鼠的腎小球損傷表現(xiàn)為腎小球肥大和腎小球系膜細胞外基質(zhì)積聚。與正常對照組相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12周后出現(xiàn)明顯的腎小球面積和系膜基質(zhì)面積增大；腎小球內(nèi)膜與腎小球囊發(fā)生粘連；并且PAS病理染色發(fā)現(xiàn)腎組織基質(zhì)成分明顯增多（圖1），提示糖尿病大鼠12周后出現(xiàn)明顯的腎臟肥大，腎小球硬化和腎功能受損。

2.2 糖尿病大鼠腎臟SphK1－S1P信號通路被激活 為了觀察糖尿病狀態(tài)下大鼠腎組織SphK1－S1P信號通路的變化，檢測了正常對照組和糖尿病模型組大鼠腎組織的SphK1的表達及活性和S1P水平。采用Real－time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠腎臟SphK1mRNA水平是對照組的3倍，而SphK2mRNA水平?jīng)]有變化（圖2）。此外，免疫組織化學(xué)和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟SphK1蛋白表達也有顯著升高（圖3）。LC－MS／MS實驗結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟SphK1活性顯著增加（圖4A）；并且S1P水平顯著增加（圖4B）。結(jié)果顯示糖尿病狀態(tài)下大鼠腎組織SphK1－S1P信號通路處于激活狀態(tài)，與作者已報道的糖尿病小鼠模型實驗結(jié)果一致［9］。糖尿病大小鼠模型實驗結(jié)果均提示SphK1－S1P信號通路的激活可能參與了糖尿病腎損害的病理進程。

圖1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟系膜區(qū)基質(zhì)分泌情況（PAS，×200）

圖2 Real－time PCR檢測糖尿病大鼠腎臟SphK1和SphK2mRNA水平

圖3 SphK1在糖尿病腎臟組織中的表達

表1 血糖及腎功能指標檢測

表1 血糖及腎功能指標檢測

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對照組比較。

組別 血糖（mmol／L） 腎重／體質(zhì)量（mg／g） 尿蛋白（mg／24h）對照組5.30±0.16 6.17±0.21 2.09±0.15糖尿病組 23.56±2.27b 18.23±0.72a 13.15±1.12a

圖4 液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）分別檢測SphK1活性和S1P含量

3 討 論

研究表明長期高血糖、糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等可激活SphK1，進而導(dǎo)致S1P的生成增加［10］，促進腎小球系膜細胞增殖［11］等。腎臟纖維化是糖尿病腎病的主要病理特征之一，GMC是腎小球的主要功能細胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用；現(xiàn)已認為GMC參與了糖尿病腎病、腎小球硬化的損傷過程［12］。糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細胞中細胞外基質(zhì)的積聚，促進了腎臟纖維化的病理進程［13］。

本研究觀察到糖尿病大鼠腎臟在SphK1－S1P信號通路的激活。本實驗采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型觀察到SphK1－S1P信號通路與糖尿病腎病存在密切相關(guān)性。研究報道，在STZ誘導(dǎo)的大鼠4～5h后，其腎小球系膜細胞發(fā)生增殖，與此同時，SphK－S1P信號通路被激活［14－15］。并且，作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在四氧嘧啶誘導(dǎo)12周的糖尿病小鼠，腎實質(zhì)與腎功能明顯受損，腎臟存在SphK－S1P信號通路的激活［9］。在本研究中，采用STZ誘導(dǎo)的12周糖尿病大鼠，腎臟亦明顯損害，腎臟SphK1－S1P信號通路被激活。研究結(jié)果進一步提示，SphK1－S1P信號通路被體內(nèi)高血糖激活后，可能參與了糖尿病腎損傷的病理進程。

綜上所述，作者通過體內(nèi)實驗證實SphK1－S1P信號通路的激活可能參與了糖尿病腎損傷的病理進程。SphK1－S1P信號通路如何影響糖尿病腎病的進程有待進一步研究證明。本研究為進一步探明糖尿病腎病的病變機制、探索將SphK1－S1P信號通路作為抗糖尿病腎病的新的作用靶點提供了一定客觀依據(jù)。

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