裴 強(qiáng)， 桑文鳳， 趙習(xí)德*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝 453100;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

由動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis)所導(dǎo)致的心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的一大類疾病，致死率和致殘率居所有疾病之首，有“頭號(hào)殺手”之稱。目前對(duì)大血管損傷及其機(jī)制的研究資料豐富，但對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)微血管的結(jié)構(gòu)和功能改變及其分子機(jī)制的研究缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)資料。有報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白-2(MMP-2)參與心臟和動(dòng)脈重塑［1］，通過下調(diào)MMP-2的表達(dá)防止心臟擴(kuò)張，保護(hù)心肌收縮力，減輕心肌纖維化［2］。但其與微小血管病變間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究通過藥物干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠，檢測(cè)其微小血管密度及MMP-2表達(dá)的變化，觀察桂枝茯苓膠囊對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)冠脈微小血管的影響及其可能的作用機(jī)制。西藥卡托普利［3］和辛伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化均有良好的防治作用，另有報(bào)道認(rèn)為辛伐他汀有促進(jìn)缺血心肌毛細(xì)血管新生的作用，進(jìn)而保護(hù)缺血心?。?］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠50只(購于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，7～8周齡，體質(zhì)量180～230 g。飼養(yǎng)在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要藥品與試劑 桂枝茯苓膠囊 (江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):100946);辛伐他汀(北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):20110114);卡托普利 (上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào):110301);維生素D3針 (上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):100103);兔抗大鼠平滑肌α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、兔抗大鼠層黏素多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-2抗體 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 造模方法及動(dòng)物分組 大鼠購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)將大鼠隨機(jī)分成兩組?？瞻捉M為12只，給予普通飼料喂養(yǎng);造模組為38只，按文獻(xiàn)的方法［5］稍加改進(jìn)，采用高脂飼料 (配制方法為78.5%普通飼料，1%膽固醇，0.5%豬膽鹽，10%熟牛油，10%蛋黃粉)喂養(yǎng)與維生素D3腹腔注射(實(shí)驗(yàn)第1周，維生素D3700 000 U/kg，分3次注射，間隔2 d)相結(jié)合的方法復(fù)制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的模型。兩組均喂養(yǎng)8周后各取2只處死，取血及主動(dòng)脈，測(cè)血脂及病理形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)造模成功后造模組改為減半高脂的飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠隨機(jī)分為3組，模型組、西藥對(duì)照組、治療組，每組12只。

1.4 藥物干預(yù) 造模成功后開始灌胃給藥，時(shí)間為6周。藥物灌胃前用生理鹽水配成溶液。模型組及空白組均給予生理鹽水 ［8 mL/(kg·d)］;西藥組給予辛伐他汀 ［0.86 mg/(kg·d)］和卡托普利［4.3 mg/(kg·d)］;治療組給予桂枝茯苓膠囊［0.24 g/(kg·d)］。

1.5 標(biāo)本采集與制備 各組大鼠禁食、水12 h，0.2%水合氯醛腹腔注射麻醉，心尖取血后快速打開胸腹腔，鈍性剝離升主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈分叉處并剪斷，取出帶有胸主動(dòng)脈的心臟，生理鹽水沖洗后置10%中性甲醛溶液中固定。剪取胸主動(dòng)脈約0.5 cm，心臟保留左心室及室間隔，取垂直于長軸中1/3組織，用不同濃度乙醇逐級(jí)脫水，浸蠟、包埋，切片，厚度5 μm，制備成動(dòng)脈血管橫切面做HE染色及心臟橫切面做免疫組織化學(xué)染色。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠心肌微小動(dòng)脈密度、毛細(xì)血管密度及MMP-2的表達(dá)。主要流程 (過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法，即SP法):切片脫蠟、水化，PBS液浸泡，抗原修復(fù)，滴加山羊血清工作液，室溫孵育。滴加稀釋后一抗 (兔抗大鼠)，4℃冰箱過夜。PBS沖洗，滴加生物素化二抗工作液 (生物素標(biāo)記山羊抗兔)，37℃溫箱孵育。PBS沖洗，滴加辣根酶鏈霉卵白素工作液，37℃溫箱孵育。PBS沖洗，滴加DAB顯色劑，輕度復(fù)染細(xì)胞核，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察、拍照。大鼠心肌MMP-2陽性表達(dá)的測(cè)定采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng) (Image-Pro plus)，測(cè)量其平均光密度 (MOD)。MOD越高，反映該物質(zhì)表達(dá)越強(qiáng)。每只大鼠均觀測(cè)6張切片，每張切片隨機(jī)選取相等的5個(gè)高倍視野 (×400)計(jì)算其均值。高倍鏡下直徑小于20 μm的圓形血管，抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白抗體染色呈棕黃色的是微小動(dòng)脈;油鏡視野下直徑小于8 μm的單個(gè)核標(biāo)記的血管，抗層黏素抗體染色呈現(xiàn)為藍(lán)色的是毛細(xì)血管;取10個(gè)不同視野下的均值，即是其微小動(dòng)脈密度與毛細(xì)血管密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)來表示。多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析;相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心肌微小動(dòng)脈密度、毛細(xì)血管密度、MMP-2結(jié)果 (表1)空白組可見少量、散在的呈現(xiàn)棕黃色圓形的微小動(dòng)脈 (圖1A)及多個(gè)呈現(xiàn)藍(lán)色的毛細(xì)血管 (圖2A)，模型組可見微小動(dòng)脈的數(shù)量明顯增多 (圖1B)，毛細(xì)血管數(shù)量明顯減少 (圖2B)，微小動(dòng)脈密度及毛細(xì)血管密度與空白組相比有顯著性差異 (P＜0.05)，治療組和西藥對(duì)照組微小動(dòng)脈 (圖1C、1D)及毛細(xì)血管 (圖2C、2D)的數(shù)量介于空白組與模型組之間。微小動(dòng)脈密度及毛細(xì)血管密度與模型組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)，但治療組與西藥對(duì)照組相比均無顯著性差異 (P＞0.05)。空白組心肌MMP-2僅有較淺黃色著色 (圖3A);模型組可見整個(gè)視野呈現(xiàn)較深的黃褐色 (圖3B)，MOD與空白組比較有顯著性差異 (P＜0.05);治療組及西藥對(duì)照組呈黃色，治療組染色相對(duì)西藥對(duì)照組稍淺 (圖3C、3D)，治療組、西藥對(duì)照組MOD與模型組相比均有顯著性差異 (P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異 (P＞0.05)。

表1 各組大鼠心肌微小動(dòng)脈密度、毛細(xì)血管密度、MMP-2光密度比較 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

表1 各組大鼠心肌微小動(dòng)脈密度、毛細(xì)血管密度、MMP-2光密度比較 (±s)Tab.1 Comparison of the arteriole and capillay density，optical density of MMP-2 in myocardium among the groups(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

光密度空白組組 別 動(dòng)物數(shù)/只 微小動(dòng)脈密度/(個(gè)·mm－2) 毛細(xì)血管密度/(個(gè)·mm－2) MMP-2 10 16.82±1.55 2 409.74±388.57 0.10±0.02模型組 12 31.64±3.43* 1 491.99±266.58* 0.24±0.03*西藥對(duì)照組 12 24.60±2.30＊△ 2 029.52±321.61＊△ 0.17±0.03＊△治療組 12 24.43±1.79＊△ 2 056.67±190.45＊△ 0.16±0.03＊△

圖1 大鼠心肌微小動(dòng)脈 (免疫組化染色，×400)Fig.1 Arteriole in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

2.2 心肌微小動(dòng)脈密度、毛細(xì)血管密度與MMP-2間相關(guān)分析 MMP-2表達(dá)與微小動(dòng)脈密度呈正相關(guān) (r=0.919，P＜0.05)，與毛細(xì)血管密度呈負(fù)相關(guān) (r=－0.813，P＜0.05)。

3 討論

圖2 大鼠心肌毛細(xì)血管 (免疫組化染色，油鏡)Fig.2 Capillary in myocardium in rats in each group(immunohistochemistry staining，oil immersion lens)

心肌功能的正常最終需要微循環(huán)功能的完整性。近90%的心肌血容量位于毛細(xì)血管之內(nèi)，稱為毛細(xì)血管血容量［6］。冠脈微血管病變是心肌微小動(dòng)脈、毛細(xì)血管和微小靜脈構(gòu)成的微循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生了結(jié)構(gòu)性改變及功能障礙，是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備下降的關(guān)鍵［7］。毛細(xì)血管周細(xì)胞與微小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞相延續(xù)，并被認(rèn)為隸屬于同一細(xì)胞系。某些病理情況下，周細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化成為血管的平滑肌細(xì)胞［8］，而微小動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞也能夠遷移至下游的毛細(xì)血管壁中，從而使毛細(xì)血管轉(zhuǎn)變成微小動(dòng)脈。

圖3 大鼠心肌MMP-2陽性表達(dá) (免疫組化染色×400)Fig.3 Expression of MMP-2 in rats in each group(immunohistochemistry staining，×400)

冠脈微血管病變屬中醫(yī)“絡(luò)病”范疇。病機(jī)多由氣血運(yùn)行不暢，臟腑功能失調(diào)，痰阻血瘀絡(luò)痹。治療應(yīng)痰瘀同治。桂枝茯苓膠囊 (桂枝、茯苓、牡丹皮、芍藥、桃仁)具有活血通絡(luò)，化瘀消癥功效，治療原則恰合本病病機(jī)。文獻(xiàn)報(bào)道該方的五味生藥均有抗炎作用，該藥所含的芍藥苷、苦杏仁苷、丹皮酚等有效成分可通過抑制前列腺素E2(PGE2)的合成、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、抑制血小板聚集及血栓素的生成、降低纖維蛋白溶酶的活性、增加外周血流量、促進(jìn)微血流等作用［9］改善微循環(huán)狀態(tài)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)工作也已證實(shí)桂枝茯苓膠囊具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善血管舒縮功能、抑制炎癥反應(yīng)等抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［10］。

MMP-2能特異性降解基底膜 (基底膜的降解是平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的前提之一)，能增加中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，觸發(fā)炎性反應(yīng)，產(chǎn)生的各種致炎因子又能促進(jìn)MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致毛細(xì)血管遭受進(jìn)一步破壞。MMP-2還能拮抗某些肽類物質(zhì)的舒張血管效應(yīng)，與血栓烷素協(xié)同參與縮血管反應(yīng)，而這些作用進(jìn)一步加重血管重塑和微小動(dòng)脈化生，最終導(dǎo)致心肌微小動(dòng)脈密度增加，毛細(xì)血管密度降低［11］，從而使毛細(xì)血管血容量下降，冠脈微循環(huán)障礙，心肌缺血。

本研究相關(guān)分析顯示MMP-2表達(dá)與心肌微血管病變關(guān)系密切，拮抗MMP-2表達(dá)可能有助于防止心肌微小血管病變。進(jìn)一步的藥物干預(yù)結(jié)果顯示:模型組大鼠微小動(dòng)脈密度明顯增高，毛細(xì)血管密度明顯降低，提示模型組出現(xiàn)微小血管病變。而治療組、西藥對(duì)照組與模型組相比微小血管病變程度明顯改善。桂枝茯苓膠囊治療組與西藥對(duì)照組(辛伐他汀聯(lián)合卡托普利)相比，微小血管病變程度有進(jìn)一步改善趨勢(shì)，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示桂枝茯苓膠囊能通過上調(diào)MMP-2表達(dá)改善冠脈微小血管異常改變。而這種作用可能是通過抑制血管炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等調(diào)節(jié)血脂以外的機(jī)制。具體發(fā)揮作用的有效成分及更深層次的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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