周 靜， 馬興苗， 邱碧菡， 潘林梅， 朱華旭， 范欣生

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210029)

腦缺血時(shí)，大鼠腦能量代謝紊亂［1］，血液處于高凝、高黏、高聚狀態(tài)，血栓的形成直接參與了腦缺血的發(fā)生發(fā)展，而血小板功能亢進(jìn)促進(jìn)血栓形成?？寡“寰奂种蒲ㄐ纬杉坝嘘P(guān)機(jī)制對于防治缺血性腦血管疾病具有重要意義。黃連解毒湯對腦缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用［2］。本實(shí)驗(yàn)以黃連解毒湯為試驗(yàn)體系，以抑制兔血小板聚集率為指標(biāo)，從對血小板聚集功能的影響方面探討不同精制方法前后黃連解毒湯全方和單味藥對家兔血小板聚集的影響，為黃連解毒湯的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

STEELIEX血小板聚集凝血因子分析儀 (北京世帝科學(xué)儀器公司);LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

黃連Coptis chinensisFranch、黃柏Phellodendron chinensisSchneid.、黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi、梔子Gardenia jasminoidesEllis等藥材均購自安徽省亳州市藥材總公司中藥公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn);ADP(5'-腺苷二磷酸二鈉鹽)(上海伯奧生物科技有限公司，批號:20100430);檸檬酸三鈉 (上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號:030413);氯化鈉注射液 (石家莊四藥有限公司，批號:2010031702);大孔吸附樹脂 (河北滄州寶恩化工有限公司);ZTC1+1澄清劑 (天津正天成澄清技術(shù)有限公司)。

2 動(dòng)物

新西蘭大耳白兔，雄性，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，由南京江寧縣湯山青龍山動(dòng)物繁殖場提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(蘇)2002-0027，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0008。

3 方法

3.1 樣品制備

3.1.1 全方提取液的制備 按處方比例稱取各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮2次:第1次加10倍量水，煎煮1.5 h;第2次加8倍量水，煎煮1 h，并分別用300目濾布濾過，合并濾液，待用。將一部分水提液離心 (5 000 r/min，15 min)，取上清液濃縮至0.1 g生藥/mL，作為全方提取液(組1)，備用。

3.1.2 不同大孔樹脂精制液的制備 將全方提取液 (組1)用不同樹脂 (樹脂量∶生藥量為2.5∶1)吸附，并分別以10倍生藥量蒸餾水，10倍生藥量的70%乙醇洗脫。HPD100(組7)，AB-8樹脂 (組8)，HPD450(組9)，洗脫液均濃縮至0.1 g生藥/mL。

3.1.3 AB-8大孔樹脂吸附后不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗液的制備 將全方提取液 (組1)經(jīng)過AB-8樹脂 (樹脂量∶生藥量=2.5∶1)吸附，并分別以10倍生藥量蒸餾水，10倍生藥量不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫。10%乙醇 (組10)，30%乙醇 (組11)，50%乙醇 (組12)，70%乙醇 (組8，洗脫液均濃縮至0.1 g生藥/mL。

3.1.4 不同方法精制液的制備 AB-8樹脂吸附組 (組8)，方法同3.1.2項(xiàng)中組8，洗脫液均濃縮至0.1 g生藥/mL。

醇沉組 (組13)，全方提取液 (組1)，加乙醇至含乙醇為70%，放置24 h，濾過，得醇沉液［3］，醇沉液濃縮至0.1 g生藥/mL。

絮凝組 (組14)，ZTC1+1 絮凝［4］。

A組分:先用少量蒸餾水?dāng)嚦珊隣睿缓蠹尤胄枰康恼麴s水，溶脹24 h，攪拌，配置成1%黏膠液;B組分:先配制1%醋酸，然后用少量1%醋酸溶解B組分并攪成糊狀，加入足夠量的1%醋酸，溶脹24 h，攪拌，配置成1%黏膠液。用前分別搖勻。取全方提取液 (組1)，于80℃水浴上加入藥液體積3%的B于濃縮液中，每隔30 min左右間隔攪拌1次，2 h后，同樣方法在60℃時(shí)加入藥液體積1.5%的A(B∶A=2∶1)，30～60 min后再攪拌1次。靜置12 h，取上清液將其濃縮至0.1 g生藥/mL。

3.1.5 單味藥，單味藥復(fù)配提取液及精制液的制備 黃連提取液 (組2)，黃柏提取液 (組3)，黃芩提取液 (組4)，梔子提取液 (組5)制備方法同全方提取液 (組1)。將上述四味藥按處方比例重新組合得單味藥復(fù)配提取液 (組6);精制液制備方法同3.1.2項(xiàng)中組8，黃連精制液 (組15)，黃柏精制液 (組16)，黃芩精制液 (組17)，梔子精制液 (組18)，單味藥復(fù)配精制液 (組19)。

3.2 固體量的測定［5］精密移取0.1 g生藥/mL的各組樣品20 mL，置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿 (W1)中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱定質(zhì)量 (W2)，計(jì)算固體的量。固體質(zhì)量濃度(mg/mL)=(W2－W1)/20。

3.3 富、貧血小板血漿的制備［6］將家兔固定在兔架上，采用鹽酸普魯卡因局部麻醉，頸總動(dòng)脈插管放血，用3.8%的檸檬酸三鈉溶液以1∶9抗凝，以1 000 r/min離心10 min，取出即得富血小板血漿 (PRP)，剩余部分以3 000 r/min離心，取出即得貧血小板血漿 (PPP)，備調(diào)零。

4 結(jié)果

4.1 黃連解毒湯復(fù)方、單味藥和單位復(fù)配上清液的比較采用血小板聚集功能測定法，測定黃連解毒湯復(fù)方、單味藥和單味藥復(fù)配提取液對家兔血小板聚集率的影響。其固體質(zhì)量濃度、最大聚集率以及聚集抑制率結(jié)果見表1。

與空白對照組相比，給藥組最大聚集率差異均有顯著性 (P＜0.01);表明黃連解毒湯、單味藥、單味藥復(fù)配提取液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。黃連解毒湯全方共煎 (組1)與其他組相比，固體質(zhì)量濃度最低，其血小板最大聚集抑制率高達(dá)89.03%，比單味藥材復(fù)配 (組6)、黃連 (組2)、黃柏 (組3)、黃芩 (組4)、梔子 (組5)提取液的抑制率高，見表1。

表1 全方與各單味藥材及單味復(fù)配上清的比較

4.2 經(jīng)不同樹脂精制黃連解毒湯全方的比較 采用血小板聚集功能測定法，測定黃連解毒湯復(fù)方經(jīng)不同極性大孔樹脂精制液對家兔血小板聚集率的影響。其固體質(zhì)量濃度、最大聚集率以及聚集抑制率結(jié)果見表2。

表2 全方經(jīng)不同大孔樹脂吸附精制液的比較

4.3 黃連解毒湯復(fù)方經(jīng)AB-8樹脂吸附后不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液比較 采用血小板聚集功能測定法，測定黃連解毒湯復(fù)方經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附后不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫精制液對家兔血小板聚集率的影響。其固體體積分?jǐn)?shù)、最大聚集率以及聚集抑制率結(jié)果見表3。

表3 全方經(jīng)AB-8樹脂吸附后不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫比較

4.4 不同精制方法黃連解毒湯復(fù)方精制液比較 采用血小板聚集功能測定法，測定黃連解毒湯復(fù)方經(jīng)大孔樹脂吸附、醇沉、絮凝后精制液對家兔血小板聚集率的影響。其固體質(zhì)量濃度、最大聚集率以及聚集抑制率結(jié)果見表4。

表4 3種不同精制方法比較

與空白對照組相比，給藥組最大聚集率差異均有顯著性 (P＜0.01);表明不同精制方法后的黃連解毒湯、單味藥、單味藥復(fù)配藥液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。全方經(jīng)大孔樹脂，醇沉、ZTC絮凝等法精制后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過弱極性大孔樹脂AB-8吸附且70%乙醇洗組 (組8)的固體質(zhì)量濃度低至0.29 mg/mL，而血小板最大聚集抑制率高達(dá)87.34%，比其他體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫 (組10，11，12)，醇沉 (組 13)，絮凝 (組 14)，過非極性樹脂HPD100(組7)，極性樹脂HPD450(組9)的抑制率高，見表2～4。

4.5 黃連解毒湯復(fù)方、單味藥材及復(fù)配樹脂精制物比較采用血小板聚集功能測定法，測定黃連解毒湯復(fù)方、單味藥材及復(fù)配提取液經(jīng)大孔樹脂吸附后精制液對家兔血小板聚集率的影響。其固體質(zhì)量濃度、最大聚集率以及聚集抑制率結(jié)果見表5。

表5 全方樹脂精制物與單味藥材樹脂精制物及復(fù)配的比較

與空白對照組相比，給藥組最大聚集率差異均有顯著性 (P＜0.01);表明樹脂精制后的黃連解毒湯、單味藥、單味藥復(fù)配藥液均能使家兔血小板最大聚集率大幅下降。全方 (組8)比復(fù)配單味 (組19)、黃連 (組15)、黃柏(組16)、黃芩 (組17)、梔子 (組18)精制液的最大聚集抑制率高，見表5。

結(jié)果表明，精制前后黃連解毒湯全方對血小板聚集的抑制作用優(yōu)于單味藥材復(fù)配、黃連、黃柏、黃芩、梔子單味藥材;經(jīng)樹脂處理后，全方過弱極性的樹脂AB-8，70%乙醇洗脫的固體質(zhì)量濃度最低，對家兔的血小板抑制率最高。

5 討論

5.1 中藥復(fù)方由不同品類中的數(shù)種天然產(chǎn)物構(gòu)成，不可避免地需要“去偽存真，去粗取精”因而依據(jù)不同需要，采用過濾、醇洗、醇沉、澄清劑、大孔樹脂吸附等精制方法去除伴生物質(zhì)，保留基本活性物質(zhì)。不同的精制方法因技術(shù)原理不同，不僅對復(fù)方中指標(biāo)性成分保留率不同且所除去的伴生物質(zhì)的種類與多少也有差異，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)方的藥效有所不同［14］。

5.2 腦缺血是一種病理過程復(fù)雜的疾病，其發(fā)病過程涉及到腦血流減少、缺血缺氧和能量代謝衰竭及氧自由基產(chǎn)生、炎性因子和細(xì)胞的參與等，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞潰變、死亡。血栓形成是腦缺血性疾病的主要致病因素之一;腦缺血時(shí)，凝血機(jī)制障礙導(dǎo)致血栓形成，成為腦缺血的重要病理機(jī)制之一。中藥復(fù)方作為一個(gè)復(fù)雜體系可以從不同機(jī)制抑制腦缺血［7］，已有研究證實(shí)黃連解毒湯中的黃芩苷［8］、四氫巴馬?。?］、小檗堿［10］、梔子苷［11］具有抗腦缺血作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯經(jīng)過不同的方法處理前后對血小板聚集抑制率均有顯著影響，但各組之間區(qū)別很大。

5.3 本實(shí)驗(yàn)從原液入手，發(fā)現(xiàn)全方共煎提取液對血小板聚集抑制率的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單味藥的上清液以及分煎合并后的全方上清液。根據(jù)黃連解毒湯中有效成分的性質(zhì)，選取了3種不同極性的大孔樹脂，非極性的HPD100［12］，弱極性的 AB-8［13］，極性的 HPD450［14］，均用 70% 乙醇洗脫，經(jīng)AB-8處理后的藥液固體質(zhì)量濃度大大降低且對家兔血小板聚集抑制率的影響甚大，為黃連解毒湯中有效成分的研究奠定的一定的基礎(chǔ)。選定AB-8大孔樹脂后，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)70%乙醇洗脫的優(yōu)勢明顯高于其余幾個(gè)體積分?jǐn)?shù)。再與其他精制方法，醇沉、絮凝比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AB-8樹脂處理，70%乙醇洗脫后的藥液優(yōu)勢亦未見衰退。然后根據(jù)優(yōu)選出的精制條件對全方、單味藥和單味藥復(fù)配上清液進(jìn)行精制［15］，全方的血小板抑制率依舊高于其他組別。

綜上，經(jīng)弱極性大孔樹脂AB-8吸附70%乙醇洗脫的黃連解毒湯全方固體質(zhì)量濃度最低且血小板抑制率優(yōu)勢明顯。

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