朱長強，李治國，劉勇，丁興華，楊樹廣，劉少君

抑郁癥是一種常見的慢性易復(fù)發(fā)精神疾病。目前抑郁癥及其復(fù)發(fā)的真正病因尚未闡明，高復(fù)發(fā)性是抑郁癥治療面臨的巨大難題[1-2]。研究表明，經(jīng)治療恢復(fù)后的患者約50%會在停藥后復(fù)發(fā)，而在持續(xù)藥物治療過程中復(fù)發(fā)率亦達20%～37%[3-4]。國內(nèi)外研究證實抑郁癥患者及抑郁模型動物的體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，伴有氧自由基代謝異常及抗氧化酶活性改變[5-7]。Stefanescu等[8]在首發(fā)和復(fù)發(fā)抑郁癥患者的血清中均發(fā)現(xiàn)過氧化脂質(zhì)水平升高和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性降低。但目前尚未見有關(guān)首發(fā)及再發(fā)抑郁動物模型血清中GPX-3水平變化的報道。

GPX-3是GPX家族成員中已知唯一的細胞外亞型，主要分布在血液。本實驗采用慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激(CUMS)方法建立首發(fā)和復(fù)發(fā)抑郁模型大鼠來模擬人類抑郁癥及其復(fù)發(fā)情況，檢測抑郁模型大鼠血清GPX-3含量變化，為探討抑郁癥發(fā)生及復(fù)發(fā)機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 氟西汀(Lilly公司，美國)，曠野實驗系統(tǒng)(上海吉利公司)，蛋白酶抑制劑(Sigma公司，美國)，蔗糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗動物及分組 實驗大鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，實驗前適應(yīng)環(huán)境1周，同時進行糖水適應(yīng)訓(xùn)練，即每個鼠籠上放置兩個飲水瓶，分別裝有1%的糖水和普通自來水。1周后，評定行為學(xué)指標，篩選行為學(xué)表現(xiàn)正常的成年健康雄性SD大鼠24只，體重180g～220g，隨機均分為4組(n=6)：組1(正常飼養(yǎng))，組2(CUMS)，組3(正常飼養(yǎng)+生理鹽水+正常飼養(yǎng))，組4(CUMS+氟西汀+CUMS)。

1.3 慢性輕度應(yīng)激方法 本實驗選用的CUMS方法包括9種刺激：冷水游泳(4℃，5min)，熱水游泳(42℃，5min)，傾斜鼠籠(傾斜45°，24h)，成對飼養(yǎng)(24h)，禁食(24h)，禁水(24h)，足底電擊5min(36V，20s/次，1次/10s)，晝夜顛倒(24h)，潮濕鼠籠(24h，鼠籠中加入適當水)。9種刺激隨機安排在4周內(nèi)完成，每日只能給予一種刺激，并且為使動物不能預(yù)測刺激的發(fā)生，不連續(xù)進行同種刺激。實驗組單籠飼養(yǎng)，對照組成對正常飼養(yǎng)。

1.4 抑郁動物模型的建立 組1和組3大鼠正常飼養(yǎng)，組2和組4大鼠給予4周CUMS。4周后對四組大鼠進行行為學(xué)評定。行為學(xué)評定結(jié)束后，組1和組2處死采集血清。組4大鼠給予3周氟西汀[10mg/(kg.d)]治療，組3大鼠給予3周同劑量生理鹽水。一周藥物洗脫后，再次對兩組大鼠進行行為學(xué)評定。組4大鼠再次接觸4周CUMS，組3大鼠正常飼養(yǎng)4周，兩組大鼠再次進行行為學(xué)評定，模型建立流程圖見圖1。

圖1 CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型建立流程圖Fig.1 Flow chart of experimental procedure in rat model of depression induced by CUMS

1.5 行為學(xué)評定

1.5.1 糖水消耗實驗 糖水消耗實驗時，首先禁水23h，然后在鼠籠上同時放置事先稱重的兩瓶水，分別為1%蔗糖水和普通自來水。四組大鼠飲用1h后，撤下兩瓶水并稱重，計算動物對糖水的偏好度：糖水偏好度(%)＝糖水消耗量(g)/[糖水消耗量(g)+自來水消耗量(g)]。實驗時間安排在8:00–10:30之間。1.5.2 曠野實驗 曠野敞箱內(nèi)徑長×寬×高為75cm×75cm×40cm，外周帶有視屏錄像和照明的隔音箱。大鼠放置于敞箱中央?yún)^(qū)域，錄像系統(tǒng)能自動記錄大鼠在5min內(nèi)的活動路程﹑活動次數(shù)﹑不動時間﹑中央?yún)^(qū)域活動路程及活動平均速度等數(shù)據(jù)。實驗時間安排在8:00–12:00之間。

1.6 血清樣品的采集及GPX-3含量測定 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟取血，每1ml血液中加入100μl蛋白酶抑制劑。室溫靜置1h后1500×g離心10min。收集血清，采用上海勁馬實驗設(shè)備有限公司的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒測定各組大鼠血清中GPX-3含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Sigma Plot軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗前各組行為學(xué)評定結(jié)果 基線期，大鼠經(jīng)1周環(huán)境適應(yīng)和糖水適應(yīng)性訓(xùn)練后進行行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示4組大鼠糖水偏好度﹑活動路程及不動時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 各組大鼠糖水偏好度﹑活動能力的比較(±s, n=6)Tab.1 Comparison of sucrose preference and locomotor activity among 4 groups of rats (±s, n=6)

表1 各組大鼠糖水偏好度﹑活動能力的比較(±s, n=6)Tab.1 Comparison of sucrose preference and locomotor activity among 4 groups of rats (±s, n=6)

Group Sucrose preference(%)Immobility time(s)1 80.5±12.7 2691.3±302.9 48.3±12.1 2 76.9±14.5 2639.1±708.4 47.8±9.8 3 74.8±9.1 2375.7±377.3 54.5±12.6 4 73.5±12.8 2895.3±1053.2 49.5±16.7 Distance moved(cm)

2.2 第一次CUMS后大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為 4周CUMS后，與對照組(組1﹑組3)比較，實驗組(組2﹑組4)大鼠的糖水偏好度﹑活動能力均顯著下降(P＜0.01)，表明抑郁樣大鼠模型構(gòu)建成功(表2)。

表2 CUMS后各組大鼠糖水偏好度﹑活動能力的比較(±s, n=6)Tab.2 Comparison of sucrose preference and locomotor activity among 4 groups of rats after CUMS(±s, n=6)

表2 CUMS后各組大鼠糖水偏好度﹑活動能力的比較(±s, n=6)Tab.2 Comparison of sucrose preference and locomotor activity among 4 groups of rats after CUMS(±s, n=6)

(1)P＜0.01 compared with group 1; (2)P＜0.01 compared with group 3

Group Sucrose preference(%)Distance moved (cm)Immobility time (s)1 75.2±13.7 1721.8±260.1 89.1±32.9 2 18.3±13.1(1) 331.7±140.2(1) 240.4±43.9(1)3 74.6±12.4 1815.8±153.4 79.9±27.5 4 35.5±10.6(2) 195.2±289.9(2) 254.9±51.5(2)

2.3 治療后大鼠抑郁樣行為恢復(fù)正常 組4(實驗組)抑郁樣大鼠經(jīng)21d氟西汀治療和7d藥物洗脫后，糖水偏好度(83.1%±3.67%)﹑活動路程(1807.4±626.2cm)及不動時間(90.4±34.3s)與組3(對照組)大鼠的糖水偏好度(78.2%±18.0%)﹑活動路程(1941.3±938.3cm)及不動時間(83.4±37.7s)相比無明顯差異(P＞0.05)。

2.4 再次CUMS誘導(dǎo)抑郁樣行為的復(fù)發(fā) 藥物治療后的組4(實驗組)大鼠二次接觸4周CUMS后，行為再次發(fā)生明顯變化，其糖水偏好度(41.3%±9.9%)﹑活動路程(1021.9±225.0cm)及不動時間(137.5±18.3s)與組3(對照組)大鼠(分別為77.7%±6.0%﹑1661.4±410.8cm﹑90.4±41.3)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。再次接觸CUMS刺激使大鼠的糖水偏好度﹑活動路程均明顯減少，不動時間增加，出現(xiàn)抑郁癥復(fù)發(fā)的癥狀。

2.5 首發(fā)和復(fù)發(fā)抑郁樣大鼠血清GPX-3濃度測定結(jié)果 首次CUMS后組2(抑郁樣組)大鼠血清GPX-3水平(20.5±2.5pmol/ml)明顯高于組1(對照組)GPX-3水平(14.1±2.2pmol/ml)，再次CUMS后組4(抑郁樣組)大鼠血清GPX-3水平(33.2±3.2pmol/ml)也顯著高于組3(對照組)大鼠(21.5±2.5pmol/ml)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討 論

CUMS抑郁動物模型是被廣泛認可的一種模型，具有很好的表面效應(yīng)(癥狀表現(xiàn))﹑預(yù)測效應(yīng)(藥理學(xué)特征)及結(jié)構(gòu)效應(yīng)(理論基礎(chǔ))[9-10]。Katz等[11]首次對動物展開慢性應(yīng)激研究，隨后Willner等[12]在Katz研究的基礎(chǔ)上加以改進，選用比較溫和的應(yīng)激刺激，形成了目前廣泛使用的CUMS抑郁動物模型，并以快感/興趣缺失(1%蔗糖水消耗量比例)作為衡量建模是否成功的關(guān)鍵。本實驗采用CUMS刺激方法建立首發(fā)和復(fù)發(fā)CUMS抑郁大鼠模型，模擬抑郁癥的發(fā)作及其復(fù)發(fā)，并使用糖水消耗實驗和曠野實驗[13]進行抑郁模型動物的行為學(xué)評價。在糖水消耗實驗中，與對照組相比，首次和再次CUMS處理的大鼠糖水偏好度均顯著下降(P＜0.01)，表明首次和再次CUMS刺激后的大鼠均表現(xiàn)出興趣缺失，提示其出現(xiàn)抑郁樣癥狀。同時在實驗中發(fā)現(xiàn)首次CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠經(jīng)3周氟西汀治療后，糖水偏好度恢復(fù)到對照組水平，該結(jié)果與國內(nèi)外文獻報道一致，即氟西汀治療可以使抑郁模型大鼠的興趣缺失逆轉(zhuǎn)[14-16]。在曠野實驗中，首次CUMS刺激后，實驗大鼠活動能力明顯降低(P＜0.01)；藥物治療后，實驗大鼠的活動路程和不動時間與對照組相比無明顯差異；再次接觸4周CUMS后，實驗大鼠總活動路程減少，不動時間增多(P＜0.05)。綜上可知，行為學(xué)測試結(jié)果表明CUMS可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生與抑郁癥患者的興趣缺失﹑精神活動遲滯類似的癥狀，提示首發(fā)和復(fù)發(fā)CUMS抑郁動物模型構(gòu)建成功，可用于下一步實驗研究。

GPX-3是已知GPX家族成員中唯一的細胞外亞型，是體內(nèi)重要的抗氧化酶之一[17]。它能消除機體內(nèi)的過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的損害，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可導(dǎo)致GPX-3表達變化并參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展機制，如在膀胱癌﹑乳腺癌﹑胃癌及前列腺癌中均檢測到GPX-3表達下調(diào)[18]。但目前抑郁癥患者及抑郁動物模型血清中GPX-3蛋白含量變化仍未見報道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測了抑郁模型大鼠血清GPX-3蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)首發(fā)和復(fù)發(fā)CUMS抑郁大鼠血清GPX-3蛋白水平顯著升高(P＜0.01)。已有研究顯示炎癥性腸道疾病患者血漿﹑結(jié)腸炎模型小鼠血漿及糖尿病模型大鼠心臟中存在氧化應(yīng)激，并且增多的氧自由基引起GPX-3表達水平升高[19-21]。此外，研究證明CUMS導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，即氧自由基顯著增多，并且增多的自由基進一步產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化[7]。Eren等[6]在慢性輕度應(yīng)激抑郁模型大鼠腦皮質(zhì)和血漿中均檢測到脂質(zhì)過氧化水平顯著升高。Jindal等[22]在CUMS抑郁模型小鼠腦中也檢測到脂質(zhì)過氧化水平顯著升高。根據(jù)本研究結(jié)果和既往報道，推測首發(fā)和復(fù)發(fā)CUMS抑郁大鼠血清中升高的GPX-3可能在降低抑郁樣大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平方面發(fā)揮作用，從而對大鼠機體起到一定保護作用。

綜上所述，本研究顯示CUMS可誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為，并且經(jīng)氟西汀治療恢復(fù)后再次接觸慢性應(yīng)激能再次產(chǎn)生抑郁樣癥狀，表明首發(fā)和復(fù)發(fā)抑郁樣動物模型造模成功。大鼠血清中升高的GPX-3可能在降低抑郁樣大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平方面發(fā)揮作用，從而減輕活性氧自由基對大鼠機體的損害，對大鼠機體起到一定的保護作用。GPX-3和氧化應(yīng)激之間的具體關(guān)系以及它們在首發(fā)和復(fù)發(fā)抑郁癥中的病理生理作用仍需進一步研究。

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