劉景全，馬國(guó)光，石斌，婁曉麗，劉鴻翔，施凱，梁冬雨，萬(wàn)晟霞

膿毒癥是ICU患者死亡的主要原因之一[1-2]。目前認(rèn)為，小腸上皮短肽載體1(oligopeptide transporter，PepT1)對(duì)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物短肽的轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道吸收蛋白質(zhì)的主要途徑[3]，但在膿毒癥復(fù)雜病理?xiàng)l件如內(nèi)毒素﹑缺血﹑缺氧及炎性介質(zhì)等多種因素影響下，小腸上皮PepT1的生物學(xué)變化仍不明確，相關(guān)研究甚少。新近發(fā)現(xiàn)的激素Ghrelin是一種內(nèi)源性腦腸肽，已有研究表明，膿毒癥時(shí)血清Ghrelin水平顯著下降，給予外源性Ghrelin可顯著改善膿毒癥時(shí)的急性胃腸功能損傷[4]。但膿毒癥時(shí)機(jī)體自身Ghrelin分泌水平是否影響小腸上皮PepT1的表達(dá)需進(jìn)一步探討。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型，探討膿毒癥時(shí)腸上皮PepT1表達(dá)的變化及其與Ghrelin水平的關(guān)系，以期為膿毒癥腸道功能障礙的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠48只，體重275～325g，由上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(滬)2009-0086。兔抗大鼠PepT1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，β-actin抗體﹑HRP-抗兔IgG(美國(guó)CST公司)，Gly-Sar(美國(guó)Sigma公司)，F(xiàn)Q-PCR試劑盒(美國(guó)ABI公司)。

1.2 膿毒癥模型制備 參照Rittirsch等[5]的CLP法進(jìn)行膿毒癥模型制備。大鼠麻醉后，無(wú)菌操作，腹正中切口2cm，于盲腸盲端2/3處結(jié)扎，用18G套管針將盲腸貫通，穿2個(gè)孔，擠出少許糞便，還納腹腔，縫合腹壁切口。動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物分組及處理 48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=8)和膿毒癥組(n=40)，膿毒癥組又根據(jù)模型建立后4﹑8﹑12﹑16﹑20h時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)均分為5個(gè)亞組。對(duì)照組大鼠剖腹后僅分離盲腸，不結(jié)扎和穿孔；膿毒癥組大鼠剖腹后行CLP。各組術(shù)后均給予生理鹽水30ml/kg皮下注射。

1.4 標(biāo)本采集與處理 分別于建模4﹑8﹑12﹑16﹑20h后活殺大鼠，留取靜脈血4ml待測(cè)血清Ghrelin水平。以Treitz韌帶遠(yuǎn)側(cè)6cm處為起點(diǎn)，留取上段空腸約20cm，一部分測(cè)黏膜Ghrelin水平；一部分保存于4%甲醛溶液中，待行病理觀察；一部分于4℃下制備小腸黏膜刷狀緣囊泡(BBMV)，方法參照文獻(xiàn)[6]，待測(cè)小腸上皮PepT1的表達(dá)及功能。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 小腸病理觀察 取小腸組織，在多聚甲醛水溶液中固定，組織切片，HE染色，光鏡下觀察空腸黏膜病理學(xué)變化。

1.5.2 血清及腸黏膜Ghrelin水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清及腸黏膜Ghrelin水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.5.3 Real-time qPCR檢測(cè)PepT1 mRNA表達(dá) 將制備好的BBMV按照Trizol說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PepT1特異引物：正義鏈5'-GTATGTTCTGTTCGCCTCCTTG-3'，反義鏈5'-GGTGAATGCTGGACTTGGTATG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度228bp；內(nèi)參GAPDH引物：正義鏈5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反義鏈5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度181bp。采用Taqman Probe探針?lè)?，?duì)目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)GAPDH校準(zhǔn)，分析各組樣品中PepT1目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 Western blotting檢測(cè)PepT1蛋白表達(dá) 提取50μg BBMV總蛋白，上樣于10%SDS-PAGE凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜至硝基纖維素膜；加入兔抗大鼠PepT1抗體(1:1000)室溫孵育2h，TBST漂洗3～5次，每次10min；加入HRP-抗兔IgG(1:5000)室溫孵育1h，TBST液洗膜；加ECL發(fā)光底物，于暗室內(nèi)壓片。β-actin作為加樣內(nèi)參照，稀釋鼠抗β-actin多克隆抗體(1:1500)作為一抗，稀釋HRP標(biāo)記的IgG(1:1500)作為二抗。Western blotting膠片經(jīng)UltroscanXL(Pharmacia LKB)光密度儀掃描，根據(jù)面積和深淺計(jì)算蛋白條帶的光密度(A)值(Quantity One Version4.4軟件)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有連續(xù)變量通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的資料以±s表示，行多組間單因素方差分析(Oneway ANOVA)。多組間的兩兩比較，若方差齊用Dunnett-t檢驗(yàn)，若方差不齊用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸黏膜病理改變 對(duì)照組小腸黏膜結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化，小腸微絨毛排列整齊；膿毒癥組(4﹑8﹑12﹑20h亞組)出現(xiàn)不同程度腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂﹑短縮﹑脫落，黏膜水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管出血和潰瘍形成(圖1)。

2.2 各組PepT1 mRNA表達(dá)水平比較 Real-time qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，膿毒癥8﹑12﹑16﹑20h組小腸上皮PepT1 mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)，膿毒癥各亞組小腸上皮PepT1mRNA表達(dá)水平之間無(wú)明顯差異(P＞0.05，圖2)。

2.3 各組PepT1蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，膿毒癥12﹑16﹑20h組PepT1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組及膿毒癥4﹑8h組明顯下降(P＜0.05，圖3)。

2.4 血清及腸黏膜Ghrelin水平變化 血清和腸黏膜Ghrelin水平均在建模后4h達(dá)高峰，然后逐漸下降，膿毒癥組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

2.5 Ghrelin與PepT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 膿毒癥時(shí)血清和腸黏膜Ghrelin水平均與腸上皮PepT1蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P＜0.001，圖5)。

圖1 大鼠小腸黏膜病理結(jié)構(gòu)變化(HE ×100)Fig.1 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats(HE ×100)

圖2 膿毒癥大鼠小腸上皮PepT1 mRNA表達(dá)變化Fig.2 PepT1 mRNA expression of rats with sepsis

圖3 膿毒癥大鼠腸上皮PepT1蛋白表達(dá)變化Fig.3 PepT1 protein expression of rats with sepsis

3 討 論

膿毒癥時(shí)可出現(xiàn)急性腸功能障礙，其特征是腸道吸收功能喪失，營(yíng)養(yǎng)底物尤其是蛋白質(zhì)﹑葡萄糖無(wú)法在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，機(jī)體不能維持蛋白質(zhì)﹑液體﹑電解質(zhì)和微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的平衡，出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良﹑免疫功能紊亂，并在此基礎(chǔ)上引發(fā)或加重其他器官功能衰竭[7-8]。已有研究表明，小腸上皮PepT1對(duì)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物短肽(二肽﹑三肽)的轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道吸收蛋白質(zhì)的主要途徑，其表達(dá)數(shù)量及功能活性的高低直接影響機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況及疾病預(yù)后[9]。因此，研究膿毒癥小腸上皮PepT1的生物學(xué)功能變化及調(diào)控，將為臨床感染患者的營(yíng)養(yǎng)支持模式及腸功能障礙改善提供理論依據(jù)。

CLP模型是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的膿毒癥動(dòng)物模型，能模擬腹腔膿腫發(fā)展到彌漫性腹膜炎﹑膿毒性休克和多器官功能障礙的臨床過(guò)程[10]。在此過(guò)程中，機(jī)體處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)，腸道組織細(xì)胞受到缺血﹑缺氧﹑內(nèi)毒素和炎癥的刺激，可能影響腸道上皮細(xì)胞內(nèi)PepT1的正常表達(dá)及功能發(fā)揮。Shu等[11]研究表明，腹腔注射脂多糖(LPS)可降低大鼠空腸PepT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，但此種變化并非PepT1特異的，地塞米松可通過(guò)抑制TNF-α和IL-1β釋放抑制其表達(dá)下降。目前對(duì)膿毒癥時(shí)小腸上皮PepT1表達(dá)及功能的改變認(rèn)識(shí)仍不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，建模后8h大鼠小腸上皮PepT1 mRNA水平明顯下降，建模后12h蛋白表達(dá)明顯下降，在此后膿毒癥的進(jìn)程中，即建模后12～20h，檢測(cè)到的PepT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平持續(xù)維持在較低水平，提示膿毒癥狀況下，大鼠小腸上皮PepT1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)均受到抑制，分析其可能機(jī)制為：①病理結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)小腸黏膜組織水腫，腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂﹑短縮，腸黏膜組織屏障受到損傷，可能直接破壞腸上皮PepT1，致使其分布減少；②既往研究表明，膿毒癥時(shí)由于大量炎性介質(zhì)如TNF-α﹑IL-6等釋放，抑制了腸上皮PepT1表達(dá)，引起小腸蛋白吸收障礙[12]。本研究證實(shí)了膿毒癥時(shí)機(jī)體在基因和蛋白水平下調(diào)了小腸上皮PepT1的表達(dá)，致使機(jī)體對(duì)蛋白底物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收受到抑制。

圖4 膿毒癥大鼠血清及腸黏膜Ghrelin水平變化Fig.4 Ghrelin levels in serum and intestinal mucosas of rats with sepsis

圖5 Ghrelin與PepT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between the expression levels of ghrelin and PepT1 protein

研究發(fā)現(xiàn)腸功能衰竭在很大程度上也是內(nèi)分泌功能尤其是胃腸激素﹑腦腸肽類激素分泌的衰竭。Ghrelin是1999年在大鼠胃黏膜及下丘腦中發(fā)現(xiàn)的一種腦腸肽激素，是生長(zhǎng)激素釋放激素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體，其受體廣泛分布于胃腸道組織中，在調(diào)節(jié)胃腸功能方面起著重要作用，包括促進(jìn)食欲﹑增加體重﹑促進(jìn)胃腸動(dòng)力等[13]。同時(shí)，膿毒癥時(shí)給予外源性Ghrelin可顯著增加大鼠小腸等的血管松弛度并抑制NF-λB通路，從而改善組織灌注及腸道黏膜通透性，抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生，減輕腸壁水腫，減少細(xì)菌移位，延緩膿毒癥向休克進(jìn)展，在改善膿毒癥腸功能障礙中發(fā)揮重要作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)血清和腸黏膜Ghrelin水平在建模后4h達(dá)高峰，隨著膿毒癥進(jìn)展，胃腸道功能障礙加重，出現(xiàn)胃腸分泌功能障礙，Ghrelin水平顯著下降，這與Das[4]的研究結(jié)果一致。我們推測(cè)，隨著Ghrelin分泌減少，對(duì)腸道的自我保護(hù)作用隨之減弱，續(xù)貫出現(xiàn)PepT1蛋白破壞及表達(dá)下降。進(jìn)一步分析顯示，血清和腸黏膜Ghrelin水平與腸上皮PepT1蛋白表達(dá)存在顯著正相關(guān)(r=0.792，r=0.756，P＜0.001)，提示其為保護(hù)性作用，也間接說(shuō)明Ghrelin在機(jī)體攝食和蛋白吸收中發(fā)揮重要作用。

上述結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)腸上皮PepT1蛋白表達(dá)顯著下降，Ghrelin分泌水平與PepT1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，具有保護(hù)性作用，對(duì)臨床膿毒癥嚴(yán)重感染患者的救治及營(yíng)養(yǎng)支持提供了理論支持。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討外源性Ghrelin對(duì)膿毒癥腸上皮PepT1的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。

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