閆師杰 ，廉雙秋 ，李曉丹 ，李 玲 ，朱文嬙，趙 越*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Yali）是我國(guó)白梨品系的優(yōu)良主栽品種，果實(shí)較耐貯藏，采用冷藏方法可以貯藏到第二年2～3月，鴨梨貯藏的主要問(wèn)題是近果心部位組織褐變。閆師杰[1]研究認(rèn)為，鴨梨果心較果肉過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）活性較低，維生素C及GSH含量下降較快，導(dǎo)致果心較果肉更容易積累自由基，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致膜透性升高，果心較早褐變。植物過(guò)氧化物酶（EC 1.11.1.7）的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在植物防御期間發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。整個(gè)植物生命周期POD參與廣泛的生理過(guò)程，可能是由于存在大量的同工酶和多功能酶催化反應(yīng)[4]。一方面植物POD參與生長(zhǎng)素代謝，木質(zhì)素和木栓質(zhì)形成，交聯(lián)細(xì)胞壁成分，植保素的合成，它是一族能催化H2O2、氧化還原無(wú)機(jī)氫供體的酶[5-6]；另一方面與植物逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)，例如：POD在病原菌的防御、冷凍、重金屬離子、機(jī)械損傷等因子作用下誘導(dǎo)表達(dá)[7-10]，是植物抗氧化保護(hù)酶系的重要保護(hù)酶，是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的生物標(biāo)記之一[11]。目前已從數(shù)百種物種中克隆到POD基因，在GenBank登錄的POD基因序列有1 000多個(gè)，而關(guān)于梨屬的僅有2個(gè)片段，且是不完整的POD基因序列，鴨梨完整的POD基因序列及相關(guān)信息還未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)已發(fā)表的梨屬POD基因片段，利用RACE技術(shù)從鴨梨果實(shí)中克隆得到1個(gè)完整的POD基因cDNA。通過(guò)序列分析進(jìn)一步揭示該酶的基因序列信息及表達(dá)特性，為最終調(diào)控植物體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性，抑制果實(shí)酶促褐變奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、載體和菌株

以采自河北省藁城的套袋鴨梨為試材，于2011年9月16日采摘，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)梯度降溫后放入冷庫(kù)貯藏。在貯藏期間將鴨梨果實(shí)切成塊狀于液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。克隆載體pMD18-T Vector購(gòu)于大連寶生物公司，大腸桿菌菌株E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑、DNA聚合酶、DNA純化回收試劑盒（購(gòu)自索萊寶公司）；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（購(gòu)自大連寶生物公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（購(gòu)自上海生工）；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（購(gòu)自Clontech公司）；其他常規(guī)藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上FJ478154.1公布的梨屬POD基因的mRNA及CDS信息，用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物POD-F、POD-R，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到該基因的保守片段并測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物PODF1、PODF2用于cDNA的3'RACE擴(kuò)增；設(shè)計(jì)引物PODR1、PODR2用于cDNA的5'RACE擴(kuò)增；最后根據(jù)保守區(qū)、3'RACE、5'RACEcDNA序列的拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)引物PODF3、PODR3用于POD基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。

表1 PCR反應(yīng)中使用的引物Table1 Primers in PCR

1.2.2 鴨梨POD基因cDNA全長(zhǎng)的獲得

鴨梨果實(shí)總RNA提取采用CTAB法提取[12]，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書，Oligo（dT）為引物合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板用引物對(duì)POD-F、POD-R進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min，94℃變性35 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠回收與預(yù)期目的片段大小一致的條帶，電泳檢測(cè)后連接克隆載體（pMD18-T Vector）并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選及質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆后，送交測(cè)序。

根據(jù)克隆所得到的cDNA中間序列分別設(shè)計(jì)特異性引物PODF1、PODF2、PODR1和PODR2，按照RACE試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書操作，進(jìn)行3'RACE和5'RACEcDNA末端快速擴(kuò)增，將測(cè)序所得的中間序列及3'RACE和5'RACE序列進(jìn)行拼接得到POD cDNA全長(zhǎng)序列，再根據(jù)克隆所得全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物PODF3和PODR3，以5'cDNA為模板，用于擴(kuò)增POD cDNA全長(zhǎng)，將該擴(kuò)增產(chǎn)物回收并連入克隆載體后進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨梨POD基因的全長(zhǎng)的cDNA的獲得

根據(jù)鴨梨POD基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物POD-F、POD-R，以鴨梨果實(shí)cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)度為445 bp的cDNA片段（見(jiàn)圖1A）。依據(jù)所得中間序列設(shè)計(jì)特異性引物PODF1、PODF2、PODR1、PODR2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得鴨梨POD基因的3'（見(jiàn)圖1B）和5'（見(jiàn)圖1C）cDNA末端序列，將測(cè)序后的中間片段及3'和5'末端序列拼接得全長(zhǎng)1 487 bp的鴨梨POD基因序列。再根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得基因全長(zhǎng)（見(jiàn)圖1D）。將該基因提交GenBank，基因登錄號(hào)為JQ325052。

圖1 鴨梨PbPOD基因擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis pattern of PbPOD for Yalipear

2.2 鴨梨POD基因cDNA核苷酸序列分析

利用NCBI上提供的ORFFinder對(duì)該序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鴨梨POD基因包含一個(gè)1 011 bp的編碼區(qū)（CDS）；3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)404 bp，含有典型的植物基因加尾信號(hào)序列Poly（A）；5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)72 bp，起始密碼子ATG后的第一個(gè)核苷酸為鳥(niǎo)苷酸（G），上述信息表明所克隆到的序列符合完整基因的結(jié)構(gòu)特征，是一個(gè)完整的基因序列。

2.3 鴨梨過(guò)氧化物酶基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)分析

2.3.1 過(guò)氧化物酶基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)

ORFFinder分析表明，該基因的開(kāi)放閱讀框在73～1 083 bp區(qū)域，編碼一個(gè)由336個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，推測(cè)分子質(zhì)量大小為38.4 ku，等電點(diǎn)（pI，Isoelectric point）為8.54，原子總數(shù)為5 386，分子式為C1690H2691N487O499S19，不穩(wěn)定系數(shù)為52.67，其為不穩(wěn)定親水性蛋白。

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PbPOD基因包含8個(gè)半胱氨酸形成4個(gè)二硫鍵，二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋之間由環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主且占56.6%，α-螺旋占41.3%，β-折疊結(jié)構(gòu)很少占2.1%。PbPOD與第Ⅲ類植物POD蛋白相比具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)類似性，可以初步判斷鴨梨POD屬于第Ⅲ類植物過(guò)氧化物酶超家族。通過(guò)同源建模法獲得PbPOD的理論三維結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖2（圖2彩版見(jiàn)封二）。POD分子由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，中間黃色部分為包埋著的血紅素輔基，血紅素平面上方遠(yuǎn)端的“空穴”是H2O2的作用位點(diǎn)，它還含有兩個(gè)Ca2+結(jié)合區(qū)，一個(gè)Ca2+結(jié)合區(qū)位于近端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，另一個(gè)位于遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這在第III類POD中是高度保守的。

圖2 PbPOD蛋白的三級(jí)立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted tertiary structure of the PbPOD

2.3.2 POD蛋白的功能位點(diǎn)分析

通過(guò)NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）的保守域檢索及立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具Conserved Domain Database（CDD），發(fā)現(xiàn)POD蛋白具有兩個(gè)保守功能域Cd00693（Secretory peroxidase，分泌性過(guò)氧化物酶）和Cl00196（Plant-peroxidaselike superfamily，植物過(guò)氧化物酶超家族）。進(jìn)一步證明所獲得基因就是鴨梨的過(guò)氧化物酶基因（見(jiàn)圖3，圖3彩版見(jiàn)封二）。

2.3.3 Pb-POD蛋白的分子進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PbPOD編碼的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列與海欖雌（Avicennia marina）（BAB16317.1）POD有99%的相似性，與陸地棉（Gossypium hirsutum）POD（AAA99868.1）、木欖（Bruguiera gymnorhiza）POD（ADD54644.1）、油茶（Camellia oleifera）POD（ACT21094.1）、長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）（AAY26520.1）、蓮花（Nelumbo nucifera）（ABN46984.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）（CAB71128.2）有96%的相似性，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）（CAA17163.1）、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）（ABC02343.1）有95%的相似性，煙草（Nicotiana tabacum）（AAD33072.1）有93%的相似性，甜瓜（Cucumismelo subsp.Melo）（ADN34050.1）有92%的相似性，與多個(gè)物種POD基因所編碼的蛋白序列相似性達(dá)90%以上，確定克隆得到的基因是與鴨梨褐變相關(guān)的POD基因。

圖3 PbPOD基因編碼的氨基酸序列的預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted amino acid sequenceof PbPOD

為進(jìn)一步闡明PbPOD與其他植物中POD蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，使用Clustal X軟件分析各POD蛋白序列之間的相似性，對(duì)包括PbPOD在內(nèi)的植物POD蛋白進(jìn)行聚類分析，使用MEGA5軟件構(gòu)建出一個(gè)分子進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖4）。

圖4結(jié)果顯示，PbPOD與擬南芥的POD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上距離相對(duì)最近，表明它們可能是從同一祖先進(jìn)化而來(lái)。

圖4 鴨梨PbPOD與其他植物中POD之間的分子進(jìn)化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic evolution analysisbetween PbPOD in Yalipear and other plants

3 討論與結(jié)論

本研究利用RT-PCR和RACE方法，從鴨梨果實(shí)中成功克隆出一條完整的過(guò)氧化物酶基因，該基因包含全長(zhǎng)為1 011 bp的編碼區(qū)，編碼336個(gè)氨基酸。二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋之間以環(huán)區(qū)和轉(zhuǎn)角連接為主，其次是α-螺旋，β-折疊結(jié)構(gòu)很少。蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)可以決定蛋白質(zhì)的功能，酶的功能部位常處于這種構(gòu)象區(qū)域；而α-螺旋的主要功能是對(duì)蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定作用。本研究通過(guò)序列分析和氨基酸序列比對(duì)得到的結(jié)果，為進(jìn)一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和生化特性奠定基礎(chǔ)。

已有研究表明，POD基因與木栓質(zhì)和木質(zhì)素的合成有關(guān)，而POD酶被認(rèn)為是抵抗病原侵入的重要防衛(wèi)手段[13-15]。同時(shí)，研究表明在植物受到重金屬、低溫等條件的脅迫下，POD蛋白的表達(dá)量也隨之顯著增加[16-17]。但是，基因POD在病原菌防衛(wèi)反應(yīng)和植物抗逆反應(yīng)中的作用還不完全清楚。因此，鴨梨POD基因的克隆為揭示POD結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供較好的研究材料和基礎(chǔ)，最終闡明其作用機(jī)理，為鴨梨采后酶促褐變的機(jī)理研究奠定重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

[1]閆師杰.鴨梨采后果實(shí)褐變的影響因素及發(fā)生機(jī)理的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

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