唐麗云 ，郭春和 ，鄭紅玉 ，項林盛 ，劉德輝 ，黃毓茂，焦茂興

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642;2 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006;3 廣州沃德生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510623;4 宜春學(xué)院，江西 宜春 336000)

根據(jù)抗菌肽前體的基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列特征，豬源抗菌肽被分為4 類:防御素(Defensins)超家族、Cathelieidins 家族、Cecropins 家族和NK-lysin.這些抗菌肽在豬體內(nèi)構(gòu)成了一道重要的防御體系.Cecropin P1 是1989年Lee 等［1］首次從豬小腸中分離出的Cecropin 類抗菌肽，后經(jīng)研究證實它實際是來源于豬腸道內(nèi)的蛔蟲［2-3］，其含有31 個氨基酸殘基、相對分子質(zhì)量為3 337.87、不含半胱氨酸、不形成分子內(nèi)二硫鍵、有強堿性的N-端和強疏水性的C-端，二維核磁共振分析表明Cecropin P1 空間結(jié)構(gòu)主要為一條縱貫全長的連續(xù)的α-螺旋，不存在鉸鏈結(jié)構(gòu).

Cecropin P1 的抗菌活性與昆蟲天蠶素相當(dāng)，Merrifield 等［4］發(fā)現(xiàn)它對G+菌(如巨大芽胞桿菌和化膿鏈球菌)和G-菌(如大腸埃希菌、沙門菌)都很敏感，尤其是對G-菌［5-6］.正是由于Cecropin P1 重要的抗菌活性，構(gòu)建高表達量的基因工程菌，從而為探索新的抗菌藥提供理論基礎(chǔ)具有重要意義.近年來，人們利用畢赤酵母表達體系統(tǒng)已經(jīng)成功地表達了抗菌肽Cecropin P1［7-8］，然而對其生物活性的分析基本是在未純化的基礎(chǔ)上進行，很難排除其他因素對抗菌肽活性的影響.因此本試驗在已有研究基礎(chǔ)上構(gòu)建了PpicZαA-cecropin P1 重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母X-33 中進行了高效表達，利用綜合純化方法對抗菌肽Cecropin P1 進行純化，再對其生物活性進行分析.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Pichia pastoris 受體菌X-33、表達載體PpicZ αA 為Invitrogen 公司產(chǎn)品、大腸埃希菌Escherichia coli(DH5α)ATCC25922、金黃色葡萄球菌Streptococcus suis ATCC29213 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室保存.

1.1.2 主要試劑與材料 EX Taq DNA 聚合酶T4 DNA Ligase 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ、AvrⅡ以及預(yù)染蛋白質(zhì)低分子Marker 為TaKaRa 公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品;Zeocin 為Invitrogen 公司產(chǎn)品;Tricine 為北京鼎國生物技術(shù)公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 Cecropin P1 全基因的擴增及重組表達載體的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的Cecropin P1 氨基酸序列，在其兩端添加表達載體的同源序列，利用重疊區(qū)基因擴增拼接法(SOEing 法)［9］和Touchdown(TD)PCR技術(shù)合成抗菌肽基因.PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒回收后進行XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，與相同雙酶切處理的酵母表達載體PpicZαA 連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PpicZαA-Cecropin P1，其具體操作見文獻［10］，重組質(zhì)粒經(jīng)缺失酶切位點鑒定和PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒送廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司測序.

1.2.2 重組載體轉(zhuǎn)化 P.pastoris X-33 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定:將感受態(tài)P.pastoris X-33(70 μL)與AvrⅡ線性化的PpicZαA-cecropin P1(20 μg)混合，305 V、200 Ω電擊15 ms.將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞鋪于新鮮制備的Yeast peptone dextrose sepharose(簡稱YPDS)平板(含100 μg/mL Zeocin)上，將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(需要2～4 d).采用煮-凍-煮法制備PCR 模板［11］，分析P.pastoris 轉(zhuǎn)化子.

用位于載體PpicZα A 多克隆位點之前和位于Cecropin P1 基因區(qū)的2 條引物進行PCR 鑒定，所擴增的片段長度為391 bp.引物基因序列為:P1:5'-GTCCCTATTTCAATCAAT-3';P2:5'-GACCACCTTGAATAGCAAT-3'.

陽性轉(zhuǎn)化子再經(jīng)不同質(zhì)量濃度Zeocin 的YPD平板挑選高拷貝克隆，用于表達目的蛋白.

1.2.3 重組P.pastoris 誘導(dǎo)表達 用滅菌牙簽挑取具有Zeocin 抗性的單菌落，于5 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中進行一級培養(yǎng)，30℃、170 r/min 振蕩過夜，至D600nm為2～6 時取1 mL 培養(yǎng)液，重懸于30 mL 的YPD 中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔12 h 取出1 mL 培養(yǎng)液，3 000 r/min 離心5 min，收集培養(yǎng)液上清液用體積分數(shù)為100%的三氯乙酸沉淀上清液，冰浴0.5 h以上，10 000 r/min 離心15 min，收集沉淀，溶解于100 μL PBS 溶液中，以Tricine-SDS-PAGE 分析表達產(chǎn)物，另取50 μL 表達上清液做抑菌試驗初步鑒定活性.

1.2.4 表達產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE 鑒定 參照文獻［12］的方法進行.

1.2.5 重組抗菌肽的蛋白質(zhì)量濃度測定及抑菌活性測定 DNA/RNA 微量定量儀測定蛋白質(zhì)量濃度.抑菌活性測定采用標準瓊脂孔穴擴散法:將處于對數(shù)生長期的大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213 懸浮液(D600nm≈0.5)各10 μL，與55℃的LB 固體培養(yǎng)基30 mL 混勻后鋪平板，待其凝固后，用滅菌的打孔器(直徑3 mm)打孔，分別滴加150 μL 煮過0.5 h 和未處理的Cecropin P1 樣品，37℃培養(yǎng)過夜，以同體積的PpicZαA 空載體轉(zhuǎn)化酵母表達蛋白為陰性對照，氨芐青霉素(Amp+)為陽性對照，第2 天測量抑菌圈直徑.

1.2.6 Cecropin P1 的純化、凍干濃縮、活性檢測及Tricine-SDS-PAGE 鑒定 根據(jù)Cecropin P1 生物活性分析結(jié)果，將抗菌肽表達上清液在沸水中煮0.5 h 后離心，取離心后上清液進行Sephadex G-25 層析純化，純化產(chǎn)物凍干濃縮后，再溶解進行瓊脂擴散法和Tricine-SDS-PAGE 鑒定.

1.2.7 溫度、酸堿、胰酶和胃蛋白酶處理 將純化后的抗菌肽Cecropin P1 分別沸水浴0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，瓊脂擴散法進行抑菌試驗，以PpicZαA 空載體轉(zhuǎn)化酵母的表達上清液和未煮沸的抗菌肽Cecropin P1 作為對照，第2 天測量抑菌圈直徑;用鹽酸和氫氧化鈉將抗菌肽Cecropin P1 表達上清液的pH 分別調(diào)為3 和9，于室溫分別放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，瓊脂擴散法進行抑菌試驗，以PpicZαA 空載體轉(zhuǎn)化酵母的表達上清液和未煮沸的抗菌肽Cecropin P1 作為對照，第2 天測量抑菌圈直徑;用鹽酸和氫氧化鈉將純化并用ddH2O 溶解的抗菌肽Cecropin P1 的pH 調(diào)為7.5，加胰酶于37℃水浴鍋中分別放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 后調(diào)回溶解時的pH(5.0)，瓊脂擴散法進行抑菌試驗，以PpicZαA空載體轉(zhuǎn)化酵母的表達上清液和未煮沸的抗菌肽Cecropin P1 作為對照，第2 天測量抑菌圈直徑;用鹽酸和氫氧化鈉將抗菌肽Cecropin P1 表達上清液的pH 調(diào)為2，加胃蛋白酶于37℃水浴鍋中分別放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 后調(diào)回溶解時的pH(5.0)，瓊脂擴散法進行抑菌試驗，以PpicZαA 空載體轉(zhuǎn)化酵母的表達上清液和未煮沸的抗菌肽Cecropin P1 作為對照，第2 天測量抑菌圈直徑.

1.2.8 單純酸和堿對大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213 生長的抑制 使用乳酸和氫氧化鈉配成pH=2～10 的溶液，瓊脂擴散法進行抑菌試驗，觀察對大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213 抑菌圈的直徑大小.

2 結(jié)果

2.1 Cecropin P1 基因的合成及表達載體的構(gòu)建及鑒定

以合成的2 條引物互為模板進行TD-PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.01 kg/L 瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到大小約100 bp 的單一條帶(圖1)，與設(shè)計相符.回收Cecropin P1 基因片段并定向插入酵母表達載體PpicZαA 中，以P1 和P2 為引物進行PCR 鑒定，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.01 kg/L 瓊脂糖凝電泳，可觀察到大小約為291 bp 的單一條帶(圖1)，送檢測序結(jié)果，Cecropin P1 基因為102 bp(與所設(shè)計基因片段大小相符)，并已成功插入表達載體.

圖1 Cecropin P1 全基因擴增產(chǎn)物和表達載體的PCR 鑒定Fig.1 Gel electrophoresis analysis of gene amplification product and expression vector by PCR

2.2 表達產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE、蛋白質(zhì)量濃度測定及抑菌活性的初步鑒定

Tricine-SDS-PAGE 顯示有1 條相對分子質(zhì)量約3 300的條帶;根據(jù)BSA 蛋白定量法測得表達上清液的蛋白總質(zhì)量濃度為179 mg/L;運用瓊脂擴散法鑒定，原表達上清液和經(jīng)過煮沸0.5 h 的Cecropin P1對大腸埃希菌ATCC25922 都有抑菌活性，抑菌圈直徑分別為13 和12 mm(圖2).

圖2 抗菌肽Cecropin P1 的表達與鑒定Fig.2 The expression and identification of peptide cecropin P1

2.3 抗菌肽Cecropin P1 的純化及純度鑒定

表達產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25 層析純化后收集不同的波峰進行凍干濃縮，瓊脂擴散法檢測發(fā)現(xiàn)只有波峰2 有抑菌活性，并且在經(jīng)過常溫放置1 個月后再進行瓊脂糖擴散試驗，發(fā)現(xiàn)波峰2 依然保持同樣的活性;將3 個波峰進行Tricine-SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)也只有波峰2 處于相對分子質(zhì)量3 300 左右的位置，并與未純化的抗菌肽Cecropin P1 表達上清液更加明亮(圖3).

2.4 高溫、酸堿度、胃蛋白酶以及胰酶對Cecropin P1 的抑菌活性的影響

抗菌肽Cecropin P1 沸水浴1 h 后抑菌圈有微弱變化(變小)，2.5 h后仍具有活性(表1).由此可見，Cecropin P1 的熱穩(wěn)定性很好，高溫2 h 仍不能完全破壞抗菌肽Cecropin P1 的結(jié)構(gòu)和抑菌活性.

圖3 抗菌肽Cecropin P1 的純化Fig.3 The purification of peptide Cecropin P1

表1 高溫、酸堿度、胃蛋白酶及胰酶對Cecropin P1 抑菌活性的影響Tab.1 The antibacterial activity of Cecropin P1 treated with high temperature and in acidity，alkalinity，pepsin and trypsin

抗菌肽Cecropin P1 經(jīng)酸處理2.5 h 后抑菌圈僅有微弱變化(變小)，但在堿性環(huán)境中處理后活性明顯下降(表1).由此可見，Cecropin P1 具有強耐酸性，但耐堿性差.

抗菌肽Cecropin P1 胃蛋白酶處理后抑菌圈變化微弱，2.5 h 后依然具有活性(表1).但是經(jīng)胰酶處理后0.5 h 活性變化明顯，不過2.5 h 后仍有活性(表1).由此可見，Cecropin P1 能抗胰酶和胃蛋白酶.

2.5 單純酸堿度的抑菌圈試驗結(jié)果

由表2 可見，在pH=5～8 的純酸堿下，對大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213 的生長是沒有影響的，前面所述試驗中使用的pH 都是在該范圍內(nèi)進行，因此抑菌圈大小不受酸堿度的影響;從pH=4 及pH=9 開始出現(xiàn)抑菌圈，且隨著酸堿度增高，抑菌圈越大.

表2 不同pH 下2 種細菌的抑菌圈直徑Tab.2 The antibacterial diameter of different pH in two bacteria

3 討論

抗菌肽在成為抗生素替代物及成為抗病毒的特效藥等方面都具有廣闊的前景，雖然基因工程的方法生產(chǎn)抗菌肽較天然提取和人工合成具有明顯的優(yōu)勢，但是現(xiàn)有的表達系統(tǒng)存在表達量低的問題，而且我國蛋白純化技術(shù)起步較晚，純化技術(shù)還相對落后，如何獲得高表達量抗菌肽及如何純化是擺在我們面前的問題.

本研究選用巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達Cecropin P1，主要是因為巴斯德畢赤酵母自身不受抗菌肽的毒害，并且具有翻譯修飾過程，且自身分泌的蛋白少，有利于純化.這諸多優(yōu)勢使得巴斯德畢赤酵母被廣泛用于重組蛋白表達，但是不同的外源蛋白在該系統(tǒng)中的表達量高低不等，高的如明膠，可達1 418 mg/L［13］，低的只有1～5 mg/L［14］.造成表達量高低差異的根本原因是影響外源基因在畢赤酵母中表達的因素很多，主要受外源基因本身特性及發(fā)酵環(huán)境的影響.經(jīng)過多次摸索后發(fā)現(xiàn)，電穿孔參數(shù)設(shè)為電壓305 V、電容25 μF、電阻200 Ω、電擊時間15 ms，電轉(zhuǎn)的效率最高，因為低電壓可以降低電轉(zhuǎn)所導(dǎo)致的感受態(tài)酵母死亡率，從而提高轉(zhuǎn)化效率;再通過ZeocinTM 抗性梯度篩選和PCR 復(fù)篩獲得高拷貝的轉(zhuǎn)化子;在培養(yǎng)發(fā)酵過程中，探索發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)96 h，抗菌肽表達量最高，于此時段收集;另外選擇了發(fā)酵表達法，獲得了比誘導(dǎo)表達法(另文發(fā)表)更高的表達量179 mg/L.

分離純化抗菌肽一般分3 步:預(yù)處理、粗分級分離和細分級分離.根據(jù)所分離的抗菌肽特性分離方法又有所差別，根據(jù)本試驗結(jié)果抗菌肽Cecropin P1 具有如下特性:(1)耐熱性，即沸水浴處理30 min 仍保持抗菌活性;(2)相對分子質(zhì)量低(≥3 300，＜50 000);(3)具有較強的抗菌活性(對大腸埃希菌具有較強的抗菌活性);(4)水溶性好.綜合抗菌肽Cecropin P1的特性以及由于表達上清液含有未知蛋白質(zhì)、鹽類和其他小分子，預(yù)熱處理可以除去部分大蛋白，而選用Sephadex G-25 可以將鹽類和分子大小不同的蛋白質(zhì)分開，因此本試驗選擇通過預(yù)處理——Sephadex G-25 凝膠層析兩步法對其純化，Tricine-SDS-PAGE 鑒定，最終獲得了組分較純的抗菌肽Cecropin P1.

國內(nèi)已有很多研究對抗菌肽Cecropin P1 進行了表達和生物活性分析［7-8］，但重點傾向于提高其表達量，并且對其生物活性分析基本是在未純化的基礎(chǔ)上進行，很難排除其他因素對抗菌肽活性造成的影響;另外，酵母表達系統(tǒng)表達的抗菌肽溶于培養(yǎng)上清液，該上清液呈強酸性(pH 可達3)，直接采用上清液來進行抗菌肽的生物活性分析，很難排除是否為強酸性導(dǎo)致，本研究對抗菌肽Cecropin P1 表達產(chǎn)物純化后，溶解所得的溶液pH≈5，該pH 對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長無影響.對純化后的抗菌肽Cecropin P1 進行耐熱、耐酸堿和耐酶的活性分析，結(jié)果表明Cecropin P1 具有較強的熱穩(wěn)定性，酸穩(wěn)定性及胃蛋白酶穩(wěn)定性，但是在堿性環(huán)境下和胰酶作用下抑菌活性明顯下降.得到的數(shù)據(jù)更加可靠，豐富了抗菌肽Cecropin P1 開發(fā)成為抗生素替代物的理論基礎(chǔ)，同時為重組表達的抗菌肽Cecropin P1 后續(xù)的抗病毒活性分析以及其他探索提供了基礎(chǔ).

［1］LEE J Y，BOMAN A，SUN Chuanxin，et al.Antibaeterial peptides from pig intestine:Isolation of amammalian cecropin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(23):9159-9162.

［2］ANDERSSON M，BOMAN A，BOMAN H G.Ascaris nematodes from pig and human make three antibact-erial peptides:Isolation of cecropin P1 and two ASABF peptides［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60(3):599-606.

［3］PILLAI A，UENO S，ZHANG Hong，et al.Cecropin P1 and novel nematode cecropins:A bacteria-inducible antimicrobial peptide family in the nematode Ascaris suum［J］.Biochem J，2005，390(Pt1):207-214.

［4］MERRIFIELD R B，MERRIFIELD E L，JUVVADI P，et al.Design and synthesis of antimicrobial peptides［J］.Ciba Found Symp，1994，186:5-20.

［5］AGERBERTH B，LEE J Y，BERGMAN T，et al.Amino acid sequence of PR-39:Isolation from pig intestine of a new member of the family of praline-arginine-rich antibacterial peptides［J］.Eur J Biochem，1991，202(3):849-854.

［6］LEE I H，CHO Y，LEHRER R.Effect of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins［J］.Infect Immun，1997，65(7):2898-2903.

［7］周玉珍.豬小腸抗菌肽cecropin P1 在畢赤酵母中的分泌表達及其生物活性研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［8］李巍，仲飛，李秀錦，等.重組豬蛔蟲抗菌肽cecropin P1在畢赤酵母中的表達及抑菌活性［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31(8):1133-1137.

［9］HO S N，HUNT H D，HORTON R M，et al.Site-directed muta-genesis by overlap extension using the polymerase chain reaction［J］.Gene，1989，77(1):51-59.

［10］薩姆布魯克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T，等.分子克隆實驗指南［M］.2 版.金冬燕，黎孟楓，譯.北京:科學(xué)出版社，1987.

［11］劇海，粱東春，郭剛，等.用于PCR 實驗的畢赤酵母基因組DNA 制備方法的比較［J］.天津醫(yī)藥，2003，31(5):270-272.

［12］曹佐武.有效分離1kDa 小肽的Tricine-SDS-PAGE 方法［J］.中國生物工程雜志，2004，24(1)，74-76.

［13］GRINNA L S，TSCHOPP J F.Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccha-rides from the methylotrophic yeast，Pichia pastoris［J］.Yeast，1989，5(2):107-1151.

［14］龔杰萬，劉飛鵬.抗菌肽基因misgurin 同向串連表達載體構(gòu)建新策略［J］.生物技術(shù)，2002(1):1-2.