華再東 ，劉西梅 ，畢延震 ，華 升，鄭新民

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064;2 武漢金鷹牧業(yè)有限公司，湖北 武漢 430209)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植研究經(jīng)歷時(shí)間并不長(zhǎng)，以1997年英國Roslin 研究所Wilmut 實(shí)驗(yàn)室“多利羊”的誕生為標(biāo)志，揭開了體細(xì)胞核移植的序幕［1］.1998年，Wakayama 等［2］用顆粒細(xì)胞作供核細(xì)胞克隆出了小鼠.同年，Cibelli 等［3］得到第1 頭體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因牛.但由于豬的特殊生殖特點(diǎn)，導(dǎo)致利用細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的發(fā)展比較滯后，直到2000年，Polejaeva 等［4］才獲得首例體細(xì)胞克隆豬.2003年，Sanghwan 等［5］克隆出了表達(dá)強(qiáng)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因豬.Jagdeece 等［6］克隆出了敲除α-1，α-2 半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，從而為人類培育異種器官移植豬跨進(jìn)了一大步.在國內(nèi)通過該技術(shù)路線獲得了轉(zhuǎn)基因山羊［7］和轉(zhuǎn)基因牛［8］.馮秀亮等［9］得到了人體細(xì)胞和豬卵母細(xì)胞異種核移植囊胚.2005年8月中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授課題組獲得我國第1 頭體細(xì)胞克隆豬，我國也成為世界第7 個(gè)獲得豬體細(xì)胞克隆后代的國家［10］.盡管體細(xì)胞核移植技術(shù)已在牛、羊、小鼠、豬等動(dòng)物上獲得成功，但總效率仍較低.而豬的體細(xì)胞核移植效率更低，體外成熟卵母細(xì)胞組成的重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚的比例在7%～10%，體內(nèi)的為10%～31%，出生活仔數(shù)與移植胚的比率僅為1%左右［11］.綠色熒光蛋白(GFP)是一種水母蛋白，由于該蛋白可以在特定波長(zhǎng)紫外光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，因此可以作為標(biāo)記蛋白.以綠色熒光蛋白為標(biāo)記基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究可以使基因的檢測(cè)更為簡(jiǎn)單，因此該基因成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相關(guān)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因.為了完善克隆技術(shù)，優(yōu)化豬核移植方法和胚胎激活方式，本研究使用轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因的胎兒成纖維細(xì)胞作為供體，比較了胞質(zhì)內(nèi)和卵周間隙注射方法、供體細(xì)胞處理方法及重構(gòu)胚的融合/激活時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)GFP 克隆胚早期發(fā)育的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

DPBS 和TCM-199 為Gibco 公司產(chǎn)品，孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)為寧波激素制品廠產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材為NEST Biotech Co.，Ltd.產(chǎn)品，卵母體外成熟培養(yǎng)(IVM)以及胚胎培養(yǎng)4 孔板為Rochford Medical Ltd.產(chǎn)品.其他試劑如未特別注明，均為Sigma 公司產(chǎn)品.

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液為改良TCM-199(mTCM199)，添加3.05 mmol/L 葡萄糖，0.91 mmol/L 丙酮酸鈉，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，10 IU/mL hCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL 青霉素，50 μg/mL 硫酸鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為10%豬卵泡液(pFF);NCSU-23 +4 mg/mL BSA［12］.洗卵液用DPBS;脫卵液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%透明質(zhì)酸酶.顯微操作液為添加7.5 μg/mL 細(xì)胞松弛素B (CB)和4 mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)的HEPES 緩沖的TCM-199;融合/激活液由0.25 mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L 氯化鈣，0.1 mmol/L氯化鎂及0.5 mmol/L HEPES 組成;胚胎培養(yǎng)液為NCSU-23 +4 mg/mL BSA.

1.2 方法

1.2.1 豬胎兒成纖維細(xì)胞系的建立 從子宮內(nèi)取出胎兒，含抗生素DPBS 清洗胎兒，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，用剪刀去除胎兒頭，四肢，內(nèi)臟，DPBS 沖洗;在直徑100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)用剪刀將剩余部分剪碎，組織塊大小為1 mm3，加入少許血清，將組織塊轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底壁上;用彎頭吸管將組織塊均勻地鋪開，將鋪有組織塊的一面向上，加入15 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，再放入39℃、相對(duì)濕度為100% 、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱;培養(yǎng)6～8 h 后，將鋪有組織塊的一面翻轉(zhuǎn)過來，使細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒組織塊;培養(yǎng)5 d后觀察組織塊周圍有無細(xì)胞爬出，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者冷凍保存.具體方法參考文獻(xiàn)［13］.

1.2.2 豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pEGFP-C1 (Clontech)轉(zhuǎn)染到豬胎兒成纖維細(xì)胞，即按照試劑盒LipofectamineTM2000 (Invitrogene)所附說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染:將傳代2～5 次的細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)板，待其在無抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液中匯合90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入500 μL 含4 μg pEGFP-C1 和10 μL LipofectamineTM2000并預(yù)先在室溫孵育20 min 的無血清DMEM，混勻轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在39℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、相對(duì)濕度為100%條件下培養(yǎng)6～8 h，再換用含體積分?jǐn)?shù)為20%FBS、體積分?jǐn)?shù)為1% NEAA 的高糖DMEM 培養(yǎng).待細(xì)胞匯合90%時(shí)，將細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)至T-25，加入含0.6 mg/mL G418 的細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)篩選14 d，Leica 顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞.

供體細(xì)胞準(zhǔn)備方法:將傳代5～10 次的細(xì)胞分為2 部分，一部分長(zhǎng)至80%匯合時(shí)采取血清饑餓處理，即把細(xì)胞培養(yǎng)液FBS(Gibco)體積分?jǐn)?shù)從20%降至0.5%繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d;另一部分細(xì)胞不饑餓，即用FBS(Gibco)體積分?jǐn)?shù)為20%的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)8～10 d.按常規(guī)方法消化、離心，最后加1 mL 顯微操作液重懸細(xì)胞沉淀備用.倒置顯微鏡選擇呈綠色的細(xì)胞用作供體.

1.2.3 豬卵母細(xì)胞的采集和IVM 豬卵巢從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)采集，摘取新鮮卵巢立即置于盛有26～37℃生理鹽水(含青霉素20 萬IU/L、鏈霉素15 萬IU/L)的保溫瓶?jī)?nèi)，2 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，用適量生理鹽水(26～37℃)沖洗3～5 遍，盛于500 mL 燒杯中，放在水浴鍋(37℃)里.用鑷子夾取卵巢，再用生理鹽水潤(rùn)濕滅菌紗布包裹，采用10 mL 注射器(16 號(hào)針頭)抽吸直徑為3～8 mm 的卵泡，吸取的卵泡液匯集到置于37℃水浴保溫的尖底滅菌試管中，靜置15～20 min，棄上清液，取試管底部卵泡液于表面皿中，實(shí)體顯微鏡下觀察，撿取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，轉(zhuǎn)移到DPBS 液滴中，沖洗3～5 遍，用CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h 以上的mTCM199 培養(yǎng)基再洗3遍，然后放在39℃，相對(duì)濕度為100%，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).在體外培養(yǎng)的0～22 h 添加10 IU/mL PMSG 和hCG，22～44 h 不加激素.間隔24 h 調(diào)換約1/2～2/3 的培養(yǎng)液，并于倒置顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞擴(kuò)散狀態(tài).

1.2.4 豬卵泡液(pFF)制備 抽取卵巢上直徑4～8 mm 的卵泡，將抽取液放入離心管中離心(1 600 r/min)20 min，取上清液于超凈工作臺(tái)內(nèi)，以0.22 μm 濾膜過濾后分裝于0.5 mL 離心管中，-20℃條件冷凍保存?zhèn)溆?

1.2.5 卵母細(xì)胞成熟觀察及鑒定 COCs 培養(yǎng)44 h，在4×10 倍實(shí)體顯微鏡下觀察，將卵丘擴(kuò)散良好，胞質(zhì)發(fā)育均勻的COCs 轉(zhuǎn)移到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%透明質(zhì)酸酶溶液中，用移液器輕輕吹打脫去顆粒細(xì)胞，以第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的主要標(biāo)準(zhǔn).

1.2.6 注核 透明帶下注射法.將一個(gè)供體細(xì)胞沿去核切口注入卵周隙，供體細(xì)胞的細(xì)胞膜與去核卵母細(xì)胞的質(zhì)膜緊密接觸;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射法，將供體細(xì)胞直接注入到去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi).注射完成后檢測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)膜完整性，棄去裂解卵，對(duì)完整的存活卵進(jìn)行激活操作.

1.2.7 重構(gòu)胚胎的融合激活 將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡3 min，洗滌3～5 遍后，每批5 個(gè)放入已經(jīng)鋪滿融合液、電極寬度為1 mm 的融合槽(BTX ECM2001 電融合儀配套電激活槽)中，用自制口吸管使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行，再用ECM2001 融合儀施加60 μs、1.2 kV/cm，2 次直流電脈沖誘導(dǎo)融合并同時(shí)激活，之后將經(jīng)過電擊的重構(gòu)卵用NCSU-23 +4 mg/mL BSA 洗滌5 遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中，在39℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及相對(duì)濕度為100%條件下培養(yǎng)0.5～1 h 后判定融合.

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用卡方(χ2)檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的篩選

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pEGFP-C1(Clontech)轉(zhuǎn)染到豬胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)LipofectamineTM2000 篩選后的細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下觀察，標(biāo)記已表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆，于體視鏡下將標(biāo)記的細(xì)胞挑出，經(jīng)傳代、培養(yǎng)，即為下一步體細(xì)胞克隆的核供體細(xì)胞(圖1).

圖1 G418 篩選14 d 后的GFP 轉(zhuǎn)基因豬胎兒成纖維細(xì)胞(20×)Fig.1 Transgenic pig fetal fibroblasts cells of transfected by GFP after 14 d

2.2 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育及綠色熒光蛋白表達(dá)檢測(cè)

融合的重構(gòu)胚培養(yǎng)于NCSU-23 培養(yǎng)液中，于39℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、相對(duì)濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，熒光鏡下觀察細(xì)胞發(fā)育的卵裂數(shù)情況(含2 個(gè)及2 個(gè)以上卵裂球的胚胎).胚胎構(gòu)建當(dāng)天為第0 天，培養(yǎng)48 h 熒光鏡下統(tǒng)計(jì)卵裂胚胎數(shù)(含2個(gè)及2 個(gè)以上卵裂球的胚胎)情況(圖2).

圖2 GFP 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育及綠色熒光蛋白表達(dá)結(jié)果(20×)Fig.2 GFP expression of transgenic pig somatic cell nuclear transfer embryo

2.3 供核細(xì)胞的不同處理方法對(duì)核移植胚胎分裂的影響

以胎兒成纖維細(xì)胞作供體細(xì)胞，分血清饑餓(用體積分?jǐn)?shù)0.5%的FBS 培養(yǎng)3～5 d)與不饑餓培養(yǎng)10 d 處理組，采用卵周間隙注核，重構(gòu)胚用NCSU-23為培養(yǎng)液四孔板法培養(yǎng)，2 組重構(gòu)胚分裂率差異不顯著(P＞0.05).詳見表1.

2.4 注核方法對(duì)核移植胚胎的影響

采用胞質(zhì)內(nèi)和卵周間隙對(duì)42～44 h 卵母細(xì)胞進(jìn)行注核操作，結(jié)果顯示，胞質(zhì)內(nèi)注射重構(gòu)胚的卵裂率(81.11%)與卵周間注核的卵裂率(76.80%)，差異不顯著(P＞0.05).詳見表2.

2.5 不同時(shí)間融合/激活對(duì)核移植重構(gòu)胚分裂的影響

以胎兒成纖維細(xì)胞采用卵周間隙注射法構(gòu)建重構(gòu)胚，然后重構(gòu)胚在不同時(shí)間進(jìn)行融合/激活操作(分別在0～1、2～4 和6～8 h 進(jìn)行)，再用四孔板法培養(yǎng)，培養(yǎng)液為NCSU-23.前2 組重構(gòu)胚卵裂率顯著高于第3 組(P＜0.05)，但前2 組之間無顯著差異(P＞0.05).詳見表3.

表1 供核細(xì)胞不同處理方法對(duì)核移植胚胎分裂的影響1)Tab.1 Effects of different treatments of donor cumulus cell on the cleavage rates of reconstructed embryo

表2 不同注射方式對(duì)克隆胚胎的體外早期發(fā)育影響1)Tab.2 Effects of field injection method on in vitro developmental competence of pig reconstructed embryos

表3 不同時(shí)間融合/激活對(duì)核移植重構(gòu)胚分裂的影響1)Tab.3 Effects of different fusion/activation schedules on in vitro developmental competence of pig reconstructed embryos

3 討論

綠色熒光蛋白是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的重要標(biāo)記基因.制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的前期工作中，可以將目的基因構(gòu)件與GFP 基因串聯(lián)起來一并整合，由于GFP 基因的表達(dá)產(chǎn)物在胚胎發(fā)育的早期即可檢測(cè)到，可以只選擇那些表達(dá)了GFP 的胚胎進(jìn)行移植，這樣即可以減少移植胚胎的盲目性.試驗(yàn)采用了簡(jiǎn)便易行的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體是介導(dǎo)DNA 進(jìn)入細(xì)胞的重要試劑，由于其應(yīng)用簡(jiǎn)單，效果穩(wěn)定，現(xiàn)在已經(jīng)成為非病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)染手段.本試驗(yàn)通過G418對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的篩選，形成表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，經(jīng)過挑選培養(yǎng)后用于核移植.理論上，以陽性體細(xì)胞為核供體經(jīng)過核移植獲得的胚胎，應(yīng)該都是陽性胚胎.但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并不是所有的胚胎都是陽性，這與文獻(xiàn)中的結(jié)果相符［14-15］.原因可能是顯微操作注核過程中并未打開熒光激發(fā)系統(tǒng)，直接挑取GFP 陽性細(xì)胞用于核移植;也可能由外源基因整合得不穩(wěn)定造成，因此不可避免會(huì)導(dǎo)致非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植胚胎的存在.

對(duì)供體細(xì)胞的選擇和處理在整個(gè)核移植體系中非常重要，本試驗(yàn)比較了供核細(xì)胞的不同處理方法對(duì)核移植胚胎分裂的影響.結(jié)果顯示以胎兒成纖維細(xì)胞作供體細(xì)胞，血清饑餓與非饑餓培養(yǎng)，核移植重構(gòu)胚的卵裂率差異不顯著.該結(jié)果與Wilmut 等［1］的相同.Edward 等［16］認(rèn)為，克隆胚胎和胎兒損失與供體細(xì)胞血清饑餓有關(guān)，胎兒后期流產(chǎn)可能由于DNA被破壞或DNA 不當(dāng)修復(fù).因此，造成血清饑餓得到的克隆胎兒有某些先天的生理缺陷.不采用血清饑餓，重構(gòu)胚的卵裂率并沒有降低，這有可能避免克隆胚胎或移植胎兒早期流產(chǎn).KuhhoIzer 等［17］研究也表明血清饑餓不能提高卵裂率和囊胚率.從目前研究狀況可以看出，G0 期或G2/M 期的供核細(xì)胞都能有效地在胞質(zhì)受體中進(jìn)行正常核編程.然而，F(xiàn)ioretti等［18］認(rèn)為沒有一種伴隨核移植動(dòng)物出生的細(xì)胞周期專一性標(biāo)記證明核移植的后代來源于某一特定時(shí)期.因此，對(duì)供體細(xì)胞的周期、供核與受體卵母細(xì)胞的發(fā)育同步及其最適周期的認(rèn)識(shí)等問題，還需要做更深入的研究和探討.

胞質(zhì)內(nèi)注射一般用壓電-陶瓷系統(tǒng)(Piezo-actuation)微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質(zhì)內(nèi)［19］.筆者最初也使用Piezo 系統(tǒng)，但通過多次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Piezo 系統(tǒng)和斜口針注射的效率沒有顯著差異，而Piezo 系統(tǒng)操作過程中需要在針尖裝汞和洗針比較麻煩.因此，本研究采用自制的斜口針，把整個(gè)供核細(xì)胞注入胞質(zhì)內(nèi)，不需要融合而且效果很好，其卵裂率達(dá)81.11%.這可能是由于胞質(zhì)內(nèi)注射的重構(gòu)胚供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞質(zhì)膜接觸更好，易于融合激活，有利于細(xì)胞重編程所致.也有研究認(rèn)為，移入的供核細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)逐漸在胞質(zhì)受體中消失［20］，移入的胞質(zhì)成分對(duì)重組胚的進(jìn)一步發(fā)育很重要，確保了DNA 能完全進(jìn)入去核的卵母細(xì)胞，避免為獲得供體核過程中對(duì)供體核結(jié)構(gòu)的損壞.因此，這樣能更有效地支持重組胚的發(fā)育.雖然透明帶下注射的效果不如胞質(zhì)內(nèi)注射好，但兩者總體效率沒有顯著差異，而胞質(zhì)注入法可將導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)的過程由兩步簡(jiǎn)化成一步，縮短核移植操作時(shí)間，提高克隆效率，為控制克隆胚胎的活化時(shí)間以及調(diào)整其細(xì)胞周期提供了可能.

最早的融合方法使用仙臺(tái)病毒［21］或PEG［22-23］介導(dǎo)融合，效果很不穩(wěn)定而且毒性大，而Willadsen等［24］利用胚胎細(xì)胞克隆羊試驗(yàn)中采用的直流電介導(dǎo)融合的方法，簡(jiǎn)便而且高效，目前已被廣泛使用.本研究發(fā)現(xiàn)將卵周間隙注射法構(gòu)建重構(gòu)胚在不同時(shí)間段進(jìn)行融合/激活操作，結(jié)果表明在6～8 h 融合/激活卵裂率顯著低于0～1 h 和2～4 h 組，雖然這2 組重構(gòu)胚卵裂率無顯著差異，但核移植胚胎后在2～4 h 內(nèi)融合/激活的效果更好些.這可能是體外顯微操作過程中，對(duì)卵母細(xì)胞造成一定損傷，而重構(gòu)胚后放置2～4 h，使受到損傷的卵得到恢復(fù)，有利于重構(gòu)胚的重編程，提高卵裂率.但延長(zhǎng)激活時(shí)間是否能提高核移植效率，避免克隆胚胎或移植胎兒早期流產(chǎn)，還需進(jìn)一步研究.

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