曾雪顏，李維鋮，梁梓森，剡海闊，范小龍，鐘 帆，鄧銜柏

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

胸腺是幼齡動(dòng)物重要的中樞免疫器官，是T 細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟的場(chǎng)所.雞沒(méi)有典型的淋巴結(jié)，僅有分散的以淋巴小結(jié)為主的淋巴組織［1］，因此，胸腺的功能水平在雞的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用.鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期，T 細(xì)胞的祖細(xì)胞起源于肝臟，并定居于胸腺［2-3］;出生以后，骨髓來(lái)源的前體細(xì)胞伴隨著少量的祖細(xì)胞逐日遷移到胸腺［4］.未分化的T 淋巴細(xì)胞在進(jìn)入胸腺之后，與不同類(lèi)型的胸腺上皮細(xì)胞相互作用，從而達(dá)到分化成熟［5］.

微循環(huán)是指機(jī)體內(nèi)微細(xì)血管與其周?chē)M織細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)代謝的一系列結(jié)構(gòu)和成分.微循環(huán)在實(shí)際意義上，包括微血管管道的構(gòu)筑成分以及組織細(xì)胞間隙中流動(dòng)物質(zhì)的理化特性、流速、管周情況等.胸腺通過(guò)血液循環(huán)獲得所需的營(yíng)養(yǎng)，未分化T 淋巴細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入胸腺，并經(jīng)過(guò)胸腺的微血管網(wǎng)絡(luò)成熟、分化、轉(zhuǎn)運(yùn)、參與細(xì)胞免疫.可以看出胸腺的微循環(huán)狀態(tài)直接影響到胸腺的免疫功能，因此有必要對(duì)雞胸腺進(jìn)行微循環(huán)研究.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與儀器

取健康湛江雞10 只，體質(zhì)量(1.5±0.2)kg，日齡(110±5)d.主要儀器為活體微循環(huán)觀察顯微鏡(廣州啟躍光電儀器有限公司，增設(shè)底部投射光源).

1.2 方法

1.2.1 胸腺的血管觀察 將雞窒息處死，靜置1 h，待血液在體內(nèi)凝固.將頸部皮膚從腹側(cè)正中劃開(kāi)，暴露胸腺，整體泡入體積分?jǐn)?shù)為20%甲醛中固定1 d后，血液凝固呈黑色，解剖觀察頸部血管走向及供應(yīng)胸腺的血管.

1.2.2 活體觀察胸腺微循環(huán)狀態(tài) 試驗(yàn)動(dòng)物稱質(zhì)量.頸部、胸部去毛，消毒，保定，頸部中線切開(kāi)皮膚，找到胸腺，將頸部皮膚固定在特制手術(shù)臺(tái)上，涂以鏡油，增設(shè)底部光源，在微循環(huán)觀察儀下觀察血管走向，血流狀態(tài)等.觀察過(guò)程中用37℃林格氏液保溫保濕.

1.2.3 墨汁灌注透明標(biāo)本制作 灌注液:質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 的明膠墨汁(加入體積分?jǐn)?shù)為2%的甲醛).

動(dòng)靜脈透明標(biāo)本制作:活體觀察結(jié)束后，在胸腔入口從頸總動(dòng)脈和靜脈灌入含抗凝劑的生理鹽水沖洗血管，再灌入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛，隨后立即將灌注液緩慢并保持一定壓力地灌入.灌注后結(jié)扎血管，取下胸腺，然后泡入體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛中固定1～2 d.

胸腺微血管透明標(biāo)本制作:固定后的胸腺用體積分?jǐn)?shù)為10%的H2O2漂白1～2 d，光照催化，漂白后用流水洗凈.

使用經(jīng)典的冬青油透明法透明:梯度脫水方法參照解剖學(xué)試驗(yàn)技術(shù)，取出標(biāo)本后切成約150 μm 的透明厚片，浸泡在冬青油中用解剖顯微鏡觀察.

1.2.4 蘇木精-伊紅染色切片制作 常規(guī)HE 染色.

1.2.5 圖像觀察及處理 從每組制得的胸腺切片中隨機(jī)抽取10 張，在顯微鏡下于每張切片上隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，利用圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定小葉間動(dòng)、靜脈直徑，各級(jí)毛細(xì)血管直徑和微血管面積密度，前3者每個(gè)視野測(cè)定4 個(gè)值，再取其平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 胸腺微循環(huán)觀察

2.1.1 雞胸腺血管供應(yīng) 試驗(yàn)觀察到雞的胸腺位于頸部氣管兩側(cè)皮下，與頸淺靜脈、迷走神經(jīng)、迷走動(dòng)脈等包在同一個(gè)筋膜鞘內(nèi).左右各7 葉，共14 葉，顏色粉紅(甲醛固定后顏色呈灰白).胸腺的主要血液供應(yīng)來(lái)自于迷走動(dòng)脈，這是一條起自頸總動(dòng)脈干的細(xì)小分支，分布至頸部?jī)?nèi)臟和頸中段的被皮，沿途再分支為胸腺供應(yīng)血液.迷走動(dòng)脈上升至顱底與枕動(dòng)脈發(fā)出的降支吻合.流出左右兩側(cè)胸腺的靜脈分別匯入左右頸靜脈，在胸腔入口處與鎖骨下靜脈匯合成左右前腔靜脈.流出胸腺的靜脈，有的直接匯入頸淺靜脈，有的則匯入到從皮膚收集靜脈血液的分支中，再并入頸淺靜脈(圖1).

圖1 雞胸腺血管供應(yīng)Fig.1 The blood vessels supplying to chicken thymus

2.1.2 微循環(huán)動(dòng)態(tài)觀察 本試驗(yàn)雞的胸腺平均厚度為2.6 mm，通過(guò)活體微循環(huán)顯微鏡觀察到胸腺小動(dòng)脈、分支毛細(xì)血管、網(wǎng)狀毛細(xì)血管、小靜脈等(圖2 A).微血管管徑粗細(xì)不一(圖2 B).常能觀察到血管的吻合支(圖2 C)及微血管的線流、粒流和線粒流(圖2 D).細(xì)動(dòng)脈分支形成毛細(xì)血管，管徑細(xì)(約4～6 μm)，走行長(zhǎng)而直，形狀剛健，血流快.分支毛細(xì)血管注入網(wǎng)狀毛細(xì)血管，互相交聯(lián)，走行彎曲，網(wǎng)狀毛細(xì)血管管徑較分支毛細(xì)血管粗(約5～8 μm)，血流較慢，匯集入集合毛細(xì)血管.集合毛細(xì)血管管徑較粗(約8～12 μm)，走行彎曲，外觀柔軟，途徑長(zhǎng)短不一，血流較網(wǎng)狀毛細(xì)血管快，注入細(xì)靜脈(圖2A，2B，2E).

圖2 微循環(huán)顯微鏡活體觀察結(jié)果Fig.2 The results observed by microcirculation microscope in vivo

2.1.3 雞胸腺組織結(jié)構(gòu)觀察 HE 染色切片觀察到每葉胸腺的被膜結(jié)締組織向腺體內(nèi)發(fā)出許多膈，將胸腺分隔成許多小葉，血管隨其進(jìn)入胸腺內(nèi).每個(gè)小葉可分為皮質(zhì)和髓質(zhì)(圖3 A).皮質(zhì)濃染而髓質(zhì)淡染，雞胸腺中不易找到像哺乳動(dòng)物那樣典型的胸腺小體.

試驗(yàn)雞未經(jīng)放血處理，胸腺中血管內(nèi)仍留有紅細(xì)胞，易于觀察血管大致位置.管徑較大的血管主要分布在小葉間和皮髓質(zhì)交界處，在皮質(zhì)中毛細(xì)血管密度明顯大于髓質(zhì)中毛細(xì)血管密度(圖3 B).

圖3 胸腺組織結(jié)構(gòu)顯微觀察Fig.3 Observation of the thymus structure

2.1.4 雞胸腺的微血管分布 試驗(yàn)結(jié)果顯示來(lái)自頸總動(dòng)脈分支的迷走動(dòng)脈，與頸淺靜脈、迷走神經(jīng)和胸腺鏈包裹在同一筋膜鞘中，沿途分支的主干供給頸部皮膚上的血管，發(fā)出小分支到胸腺的中央部位，進(jìn)而分支成血管樹(shù)穿透實(shí)質(zhì)形成毛細(xì)血管網(wǎng).每個(gè)獨(dú)立的胸腺小葉有2 條動(dòng)脈分布.逐漸分支的小動(dòng)脈沿著皮髓質(zhì)交界處，注入到皮質(zhì)和髓質(zhì)的毛細(xì)血管中.而另一類(lèi)皮質(zhì)動(dòng)脈，進(jìn)入胸腺后，其分支到皮質(zhì)的毛細(xì)血管中.也發(fā)現(xiàn)一些發(fā)卡狀的小動(dòng)脈，起源于髓質(zhì)動(dòng)脈，并且供應(yīng)皮質(zhì)的毛細(xì)血管，在動(dòng)脈和靜脈血管之間起到通路作用(圖4 A).

觀察發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)中的毛細(xì)血管比髓質(zhì)中的分布更為稠密(圖4 B).皮質(zhì)小動(dòng)脈呈放射狀從皮髓質(zhì)交界處向外皮層延伸，并匯入到皮質(zhì)邊緣的小靜脈中.在外皮層，許多皮質(zhì)小動(dòng)脈呈現(xiàn)螺旋、彎曲狀(圖4 C)，也流通到皮質(zhì)表面的小靜脈中.但髓質(zhì)小動(dòng)脈則形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，與靜脈連通(圖4 D).

胸腺中靜脈系統(tǒng):髓質(zhì)比皮質(zhì)中的分布更密(圖4 D).在胸腺髓質(zhì)，尤其是皮髓質(zhì)交界處，常常觀察到彎曲迂回的小靜脈(圖4 B).這些小靜脈起源于皮質(zhì)或髓質(zhì)，形成髓質(zhì)靜脈，并與小葉間靜脈連接.這些靜脈的血管內(nèi)皮表面，能夠觀察到淋巴細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞層(圖4 E).

在胸腺表面上，許多皮質(zhì)的靜脈收集了皮質(zhì)中毛細(xì)血管的血流，并匯入到小葉間靜脈(圖4 F).這些皮質(zhì)靜脈多數(shù)與穿過(guò)皮質(zhì)隔或?qū)嵸|(zhì)的髓質(zhì)靜脈匯合或吻合.皮質(zhì)的血管不存在血管周?chē)g隙.

圖4 雞胸腺的微血管分布(10×)Fig.4 The distribution of microvascular in chicken thymus

3 討論與結(jié)論

3.1 關(guān)于本試驗(yàn)所采用的微循環(huán)研究方法

本試驗(yàn)主要選用了組織切片和灌注墨汁的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，用活體微循環(huán)觀察儀進(jìn)行生理學(xué)研究.鏡下觀察組織切片方法，可以了解微血管的斷面形態(tài)、結(jié)構(gòu)，能夠觀察微血管和其周?chē)M織的關(guān)系.但一般組織切片僅能反映約5 μm 厚的斷面結(jié)構(gòu)，不能了解微血管立體分布、走行.為了補(bǔ)救組織切片方法的缺陷，可以采用連續(xù)切片，逐片觀察、描繪、復(fù)制的方法.這種方法，除具有組織切片方法的優(yōu)點(diǎn)外，又能描繪出微血管的立體分布、走行和相互關(guān)聯(lián).早期的研究利用這種方法認(rèn)識(shí)了一些臟器，如脾臟等的微血管的分布形態(tài).但也存在著工作量過(guò)大，缺少真實(shí)感等缺陷.因而在本試驗(yàn)中，選用灌注墨汁后制作透明標(biāo)本的方法彌補(bǔ)了組織切片觀察的片面性.

在血管中注入墨汁充盈微血管，再將組織透明，便可以在解剖鏡下清晰地觀察到微血管的分布、形態(tài)以及微血管的相互關(guān)系.理想的血管內(nèi)灌注液應(yīng)具備接近血液的黏稠度和較好的流動(dòng)性.試驗(yàn)采用質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 明膠墨汁.灌注后選用冬青油與苯甲酸甲酯混合液透明組織，透明效果好.胸腺浸泡在透明液中，在解剖鏡下能清晰、直觀地觀察到微血管的分布、走行、形態(tài)，以及細(xì)動(dòng)脈、毛細(xì)血管、細(xì)靜脈的相互關(guān)系等.試驗(yàn)證明，這種傳統(tǒng)的墨汁灌注透明法操作簡(jiǎn)單、所需的設(shè)備普通常見(jiàn)，不失為一種比較實(shí)用的微循環(huán)形態(tài)學(xué)研究方法.

試驗(yàn)采用活體微循環(huán)顯微儀進(jìn)行直接的活體微循環(huán)觀測(cè).本試驗(yàn)在原有的顯微鏡落射光源的基礎(chǔ)上，在底部添加透射能力強(qiáng)、亮度大的冷光源，能較為清晰地觀察到血流動(dòng)態(tài)，轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)時(shí)，能觀察到不同高低層次的微血管.但動(dòng)物不可能完全地安靜，試驗(yàn)中，觀測(cè)部位在雞的頸部，雞只的呼吸活動(dòng)等會(huì)對(duì)活體觀察造成影響，不容易得到清晰連貫的微循環(huán)錄像，這也是本試驗(yàn)所欠缺的地方.

總的來(lái)說(shuō)，本試驗(yàn)從宏觀到微觀，從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)比較詳細(xì)地觀察了雞胸腺微循環(huán).

3.2 雞胸腺的微循環(huán)特點(diǎn)

胸腺在性成熟之后會(huì)發(fā)生增齡性退化，可以說(shuō)，不同日齡的動(dòng)物的胸腺在體積上會(huì)有很大的不同.因此在試驗(yàn)動(dòng)物的選擇上，本次試驗(yàn)嚴(yán)格控制試驗(yàn)雞的日齡在110 d 左右.雞胸腺的血管豐度隨日齡增長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)［6］，這可能是由于在增齡過(guò)程中雞胸腺產(chǎn)生了大量死亡胸腺細(xì)胞［7］，胸腺血管要靠自身數(shù)量的增多才足以運(yùn)輸和清理這些死亡細(xì)胞.

嚙齒動(dòng)物類(lèi)的胸腺是黃色的，雞的胸腺是粉紅色的，這種顏色的不同尚未能解釋原因.嚙齒動(dòng)物的胸腺小葉呈現(xiàn)出一種“穿透的循環(huán)”，即毛細(xì)血管從內(nèi)向外穿透內(nèi)皮層，到達(dá)位于表面的靜脈，這一點(diǎn)與肝小葉的微循環(huán)類(lèi)似.外層皮質(zhì)占有最大的微血管密度，且胸腺細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)最高;血管密度最低的是胸腺髓質(zhì)，特別是在胸腺小體.小動(dòng)脈深入小葉髓質(zhì)，在皮髓質(zhì)交界處以下平行形成弓狀分支.皮質(zhì)毛細(xì)血管垂直進(jìn)入內(nèi)皮層，在胸腺中毛細(xì)血管密度最大的外皮質(zhì)區(qū)形成毛細(xì)血管分支.皮質(zhì)毛細(xì)血管直接連接到包膜下.有彎曲的血管從包膜底下穿行，加入到包膜靜脈.可以觀察到阻止血液逆流的毛細(xì)血管絆.一些毛細(xì)血管通向皮質(zhì)的靜脈，而其他的則環(huán)回到皮髓質(zhì)交界處的靜脈中［8］.小葉表面的靜脈，貫穿皮層，到皮髓質(zhì)交界處的深處血管中.小葉表面上動(dòng)脈和靜脈之間偶爾存在動(dòng)靜脈吻合.髓質(zhì)中一些靜脈也很明顯，血管分布模式有別于皮質(zhì)，毛細(xì)血管密度也明顯比皮質(zhì)中少.在胸腺小體中，血管數(shù)量非常少.毛細(xì)血管穿透皮質(zhì)的模式中，細(xì)胞和化學(xué)物質(zhì)的交換以及濾過(guò)過(guò)程都會(huì)增多［9］.

Henry 等［10］詳細(xì)地描述過(guò)無(wú)尾兩棲動(dòng)物胸腺的微脈管系統(tǒng).林蛙胸腺主要的動(dòng)脈血管，來(lái)源于顳動(dòng)脈或耳支，接近腺體的中央部位，分支成血管樹(shù)穿透實(shí)質(zhì)形成毛細(xì)血管網(wǎng).血管鑄型可觀察到微動(dòng)脈上有細(xì)胞核長(zhǎng)軸平行于血管拉長(zhǎng)的細(xì)胞核印跡，而微靜脈中的細(xì)胞核印跡則是圓的、薄的并隨機(jī)分布在微靜脈內(nèi)皮層里［11］.此外，還有一些小口徑的輔助動(dòng)脈支加入到胸腺表面的毛細(xì)血管叢.小鼠也有類(lèi)似的額外動(dòng)脈［12］.接近胸腺表面的胸腺血管分成幾條主要的分支穿透胸腺實(shí)質(zhì).接著發(fā)出一些更細(xì)的彎曲的分支加入到淺層的不同直徑的靜脈和毛細(xì)血管中.禽類(lèi)和小鼠也有這樣類(lèi)似的分支情況，這與本試驗(yàn)中觀察到的一致.小動(dòng)脈分支出的二級(jí)小動(dòng)脈根部有一種括約肌樣的結(jié)構(gòu)，可以控制通過(guò)淺層毛細(xì)血管網(wǎng)的血量.這一結(jié)構(gòu)能在電鏡下的血管鑄型上觀察到.這種類(lèi)似括約肌的結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物的淋巴結(jié)血管上也能觀察到［11］，但在哺乳動(dòng)物的胸腺血管中并沒(méi)有報(bào)道.

哺乳動(dòng)物的主要胸腺微動(dòng)脈和微靜脈平行地走行在皮髓質(zhì)交界處，在進(jìn)入皮質(zhì)和髓質(zhì)時(shí)彼此分開(kāi)［11，13］.通過(guò)制作血管鑄型，在掃描電鏡下觀察可見(jiàn)綿羊血管的鑄型表面有大量的細(xì)胞壓痕和印跡，這可能代表淋巴細(xì)胞滲透通過(guò)小靜脈壁.大多數(shù)髓質(zhì)的血管在血管壁與胸腺實(shí)質(zhì)之間存在血管周?chē)g隙(Perivascular space，PVS).盡管在髓質(zhì)深層，這些血管周?chē)g隙的外形有點(diǎn)不清晰，但仍可見(jiàn)在這些間隙中通常包含一至多層淋巴細(xì)胞，偶見(jiàn)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞.

3.3 結(jié)論

雞胸腺的主要血液供應(yīng)來(lái)自于迷走動(dòng)脈，該動(dòng)脈起自頸總動(dòng)脈干的細(xì)小分支，其主干延伸至頸部?jī)?nèi)臟和頸中段的被皮，沿途再分支進(jìn)入胸腺.該分支進(jìn)入胸腺后，在接近腺體的中央部位發(fā)散形成血管樹(shù)，經(jīng)過(guò)實(shí)質(zhì)形成毛細(xì)血管網(wǎng).這些毛細(xì)血管垂直朝向胸腺表面，或加入淺表的毛細(xì)血管叢，或伴隨這些毛細(xì)血管叢一段距離后返回髓質(zhì)，形成毛細(xì)血管袢.微動(dòng)脈分支組成不規(guī)則的毛細(xì)血管網(wǎng)，匯聚成毛細(xì)血管后微靜脈加入到皮髓交界處的靜脈中匯入腺體表面的血管，進(jìn)而在胸腺附近構(gòu)成靜脈樹(shù)，匯集入胸腺靜脈最后注入到頸淺靜脈.

試驗(yàn)觀察到雞胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)中血管分布不同，這體現(xiàn)了微循環(huán)與器官功能的關(guān)系.皮質(zhì)中毛細(xì)血管更為豐富，保證胸腺的血液和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng);而髓質(zhì)中靜脈比較豐富，管壁較薄、管徑較大，這更有利于T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移.另外，皮質(zhì)中毛細(xì)血管有“血胸屏障”之稱，髓質(zhì)血管則無(wú)此結(jié)構(gòu).這種特殊結(jié)構(gòu)與胸腺特有的免疫功能是相關(guān)的，它使得血液和胸腺間的物質(zhì)交換有一定限制.既能保證完成胸腺功能、代謝所必須的物質(zhì)交換，又能減少不必要的物質(zhì)進(jìn)入皮質(zhì)，特別是血液中一些大分子抗原物質(zhì)不易與胸腺淋巴細(xì)胞接觸而引起免疫反應(yīng).

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