吳則東 ，王華忠 ，馬龍彪 ，王茂芊

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

甜菜是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)作物，建國(guó)后，我國(guó)的甜菜育種事業(yè)開(kāi)始起步，從引進(jìn)國(guó)外的品系到育成自己的甜菜品種。而甜菜的種植面積也由建國(guó)時(shí)的1.59萬(wàn)公頃增加到1998年的41.5萬(wàn)公頃[1]，此后，我國(guó)甜菜種植面積開(kāi)始萎縮，目前甜菜種植面積基本維持在22萬(wàn)公頃[2]。從2000年開(kāi)始，國(guó)外的甜菜品種開(kāi)始進(jìn)入我國(guó)，并陸續(xù)占領(lǐng)中國(guó)甜菜種子市場(chǎng)，目前國(guó)外甜菜品種已經(jīng)占到中國(guó)甜菜種子市場(chǎng)的95%以上，其中德國(guó)KWS公司是外國(guó)公司在我國(guó)甜菜種子方面開(kāi)展活動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)、范圍最廣、推出品種及育種材料最多、種子繁殖及銷售量最大的公司[3]。而德國(guó)斯特儒博公司的甜菜品種近幾年來(lái)在我國(guó)的種植面積也在逐年增大。

目前我國(guó)對(duì)甜菜品種的鑒別依然采用形態(tài)學(xué)的方法，此種方法不僅鑒定周期長(zhǎng)，而且準(zhǔn)確率差。由于SSR標(biāo)記具有簡(jiǎn)單、共顯性、條帶清晰、重復(fù)性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到作物品種指紋圖譜的構(gòu)建[4]。目前甜菜SSR引物已經(jīng)有上千對(duì)[5]，完全能夠滿足品種指紋圖譜的構(gòu)建。筆者選擇生產(chǎn)上大面積推廣種植的德國(guó)品種KWS0143、KWS2409、KWS5145[6]，以及近幾年剛剛審定命名的德國(guó)品種，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，以期為品種鑒定以及維護(hù)育種公司以及農(nóng)民的利益提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)用的11份德國(guó)進(jìn)口的甜菜品種分別來(lái)自于德國(guó)的KWS公司和斯特儒博公司，所有的品種均由國(guó)內(nèi)甜菜研究機(jī)構(gòu)提供。品種名稱及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將11份甜菜種子播種于黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)溫室營(yíng)養(yǎng)缽中，待長(zhǎng)到4片真葉時(shí)，每個(gè)品種取10株，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)處理后，將葉片打磨成干粉，利用堿裂解法[7]快速提取甜菜基因組DNA，經(jīng)λDNA 檢測(cè)后，最后稀釋到 10ng/μL。

1.2.2 引物 我們從黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選出來(lái)的核心引物中選擇了5對(duì)多態(tài)性相對(duì)較高、帶型清晰、易分辨且重復(fù)性好的引物，它們是 SB09[8]、S6、S7[9]、SB04[8]和 S2[9]（表 2），引物由上海生工合成，HAP 純化，每對(duì)引物均按照說(shuō)明稀釋到10μM的工作液。

1.2.3 SSR體系及 PCR程序 反應(yīng)體系為 10μL，其中包括 10×PCR buffer 1μL， 模板 DNA 1μL，0.5μL dNTPs（2.5mM each），10μM的正反向引物各0.4μL，Taq DNA聚合酶0.5U，最后加滅菌去離子水至總體積10μL。 PCR 程序：95℃預(yù)變性 1min，然后 94℃變性 40s，54℃退火 40s，最后 72℃延伸 40s，35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，再72℃延伸5min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物于8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，然后采用快速銀染法[10]顯色并照相記錄。

表1 品種來(lái)源及其編號(hào)

表2 SSR核心引物及其序列

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)電泳的泳帶按照分子量從大到小進(jìn)行記錄，在相同的位置上，有帶記為1，無(wú)帶記為0，利用0和1數(shù)字構(gòu)建11個(gè)品種的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的擴(kuò)增

SSR擴(kuò)增銀染結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中我們可以看出，每對(duì)引物均擴(kuò)增出了清晰的條帶，每條引物擴(kuò)增出的條帶最多是8條，最少是2條，這5對(duì)引物共擴(kuò)增出34個(gè)條帶，其中31個(gè)為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占到總條帶的91.17%。

圖1 8%聚丙烯酰胺凝膠銀染圖

2.2 SSR指紋圖譜的構(gòu)建

雖然我們選擇的4對(duì)SSR引物均具有很高的多態(tài)性，但是由于甜菜的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，所以任何單一的一對(duì)引物都不能夠?qū)⑺械?1個(gè)甜菜品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，從銀染圖可以清晰地看出，單獨(dú)的SB04可以區(qū)分開(kāi)2、3和9號(hào)品種，S6能夠區(qū)分開(kāi)4、10和11號(hào)品種，S7能夠區(qū)分開(kāi)1、3和7號(hào)品種，S2能夠區(qū)分開(kāi)1、5和8號(hào)品種，而SB09中沒(méi)有特異性的條帶，不能單獨(dú)用于品種的區(qū)分。除了6號(hào)品種外，其余10個(gè)品種的鑒別只需要利用能夠區(qū)分此品種的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后再和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，就可確認(rèn)品種的真?zhèn)渭捌浼兌?。而利用S6和S7兩對(duì)引物就可以很好地把6號(hào)品種區(qū)分開(kāi)。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的品種純度鑒定的方法大都采用形態(tài)學(xué)鑒定法，形態(tài)學(xué)鑒定法不僅周期長(zhǎng)，而且鑒定的效果差，容易受到環(huán)境條件的影響。而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的品種純度和真實(shí)性的鑒定技術(shù)不受環(huán)境條件的影響，鑒定時(shí)間短，準(zhǔn)確度高。而目前的分子標(biāo)記技術(shù)中，RAPD重復(fù)性較差，AFLP不僅有專利條件的限制，而且操作復(fù)雜，一般的實(shí)驗(yàn)室難以掌握，而SRAP條帶較多，統(tǒng)計(jì)困難[11]；SSR分子標(biāo)記因其條帶較少、統(tǒng)計(jì)方便、重復(fù)性好而在種子純度和真實(shí)性鑒定中備受青睞。目前國(guó)家品種鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)都是以SSR分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的，如GB/T1433-2007《三系雜交水稻及親本真實(shí)性和品種純度鑒定DNA分析方法》、NY/T1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》、NY/T1432-2007《玉米品種鑒定DNA指紋方法》、DB51/T808-2008《雜交玉米品種真實(shí)性和純度SSR分子檢測(cè)技術(shù)方法》等等[12]。本文利用特殊引物法及指紋技術(shù)首次構(gòu)建了11個(gè)德國(guó)引進(jìn)品種的指紋圖譜，為解決將來(lái)可能出現(xiàn)的品種糾紛打下了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

致謝：非常感謝內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜研究所、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、新疆石河子農(nóng)科中心甜菜研究所在甜菜品種提供上給予的幫助。

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