樓朝霞，梅麗娜

（湖州市婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 湖州 313000）

抑癌基因是一類細胞生長的負調(diào)控基因，因基因缺失、突變、重組等導致其正常功能失活，是細胞惡性轉化的重要啟動因素，而p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤相關性最高的抑癌基因之一。野生型p53基因的蛋白產(chǎn)物能維持基因組穩(wěn)定，具有抑制或阻止細胞轉化的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生，它的失活對腫瘤形成起重要作用[1-2]。而突變型p53基因不僅失去了對細胞的監(jiān)視功能且本身還有促進惡化的活性，使細胞無限制的生長，是一種癌基因[3]。在宮頸癌中，野生型p53基因失活，而突變型p53基因產(chǎn)生突變型p53蛋白不能正常調(diào)節(jié)細胞生命活動。本研究采用PCR技術檢測宮頸癌中突變型p53基因的表達，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 材料來源 57例宮頸癌組織均取自2000年9月至2006年6月在本院行全子宮切除術標本并經(jīng)病理組織證實為宮頸癌患者，其中鱗癌56例，占98.12%，腺癌1例，占1.18%；病理Ⅰ級8例(14.10%)、Ⅱ級22例(38.16%)、Ⅲ級27例(47.14%)。其臨床大體病理分型為：菜花型31例(60.18%)、結節(jié)型17例(33.13%)、潰瘍型3例(5.19%)。按FIGO臨床分期：Ⅱ期9例，占17.16%；Ⅲ期42例，占82.14%(因6例標本缺乏臨床資料，不包括在臨床大體病理分型及臨床分期中)。宮頸癌患者取宮頸組織標本前均未接受過放療和化療。正常對照15例、慢性宮頸炎15例，來源于因子宮肌瘤行全子宮切除的標本。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 記錄患者的姓名、年齡、病程、是否經(jīng)過治療等資料。

1.2.2 基因組DNA制備 采用改良TES水浴法提取標本組織的DNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩＞唧w方法參照參考文獻[5]。

1.2.3 聚合酶鏈反應 (1)設計引物：根據(jù)Buchman等[5]的p53基因順序設計引物，選外顯子5、6、7、8作為研究對象，引物由上海夏華生物公司合成。(2)PCR操作：采用本室配制的體系。按94℃30 s、63℃ 45 s、72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，參數(shù)循環(huán)32個周期。PCR擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測 配制2%的瓊脂糖凝膠(含1.5 μg/ml溴化乙錠)，取5 μl產(chǎn)物與1 μl溴酚蘭上樣液混勻后加樣，于1×TAE緩沖液中，70 V電泳約40 min，在紫外光下觀察擴增條帶。

1.3 統(tǒng)計學方法 錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)資料表示，采用t檢驗。計數(shù)資料應用χ2檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 患者基因組DNA的含量及純度 宮頸癌患者基因組DNA的含量1～2 μg/g，其吸光度A260/A280值(即純度值)為(1.81±0.17)。

2.2 宮頸癌患者基因組DNA PCR擴增的電泳圖 由圖1可見，2、3、5、6泳道為p53突變型，1、4泳道為p53野生型，M為AL5000DN Marker。

圖1 p53基因PCR擴增電泳圖

2.3 實驗結果 突變型p53基因在宮頸正常上皮、慢性宮頸炎和宮頸癌組織中的表達率分別為：0%、40.00%和71.93%。其中宮頸癌與正常宮頸組織間陽性表達率比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，突變型p53基因在宮頸癌中的陽性表達率明顯高于慢性宮頸炎(P＜0.05)，慢性宮頸炎與正常宮頸組織間的陽性表達率差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。突變型p53基因在低分化患者宮頸癌組織中的陽性表達率明顯高于中高分化組(P＜0.05)。突變型p53基因陽性的宮頸癌患者的5年生存率明顯低于陰性的患者，見表1。突變型p53基因的表達陽性率在腫瘤的直徑、淋巴結轉移情況差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 突變型p53基因陽性與術后生存率的關系

表2 突變型p53基因陽性率與宮頸癌標本的臨床和病理指標的關系

3 討論

宮頸癌是女性生殖器最常見的惡性腫瘤之一。每年新增病例約50余萬，多發(fā)生在25～40歲，有年輕化的趨勢，而宮頸炎到癌前病變到宮頸癌有一個較長的過程，因此宮頸癌是一種可以早期預防、診斷和治愈的疾病[6]。而p53基因是與癌癥的發(fā)展密切相關，研究表明，50%以上的惡性腫瘤患者會有p53基因突變或缺失[7]。

人類p53基因位于染色體17q13，基因全長16～20 kb，編碼393個氨基酸的磷蛋白，包含11個外顯子和10個內(nèi)含子。p53基因有野生型和突變型兩種。野生型p53基因存在于正常細胞中，是一種抑癌基因，主要具有生長捕獲和誘導細胞凋亡的功能。突變型p53基因則失去上述功能[8]，促進細胞惡性轉化，是一種癌基因。在宮頸癌中，野生型p53基因失活，而突變型p53基因產(chǎn)生突變型p53蛋白不能正常調(diào)節(jié)細胞生命活動。其次，與野生型p53基因功能相關的基因網(wǎng)絡不能正常發(fā)揮功能。另外，野生型p53基因與突變型p53基因在腫瘤細胞中相結合，使野生型p53基因喪失抑癌功能也是一個重要的因素[1-3]。研究表明p53基因結構及表達異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有關，已發(fā)現(xiàn)的有肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌等等[8-9]。從本研究資料表明，宮頸癌組織標本中突變型p53基因的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織及慢性宮頸炎組織。在宮頸癌組織標本中，突變型陽性表達率臨床晚期高于臨床早期，淋巴結轉移高于淋巴結未轉移并且突變型p53基因陽性的宮頸癌患者的5年生存率明顯低于陰性的患者，揭示出突變型p53基因表達情況與宮頸癌惡性程度、臨床進展及預后密切相關。

本研究采用PCR技術，用最簡單、有效、直觀的方式從不同病理分級的宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)p53的突變類型和轉錄活性，探討突變型p53基因的表達與宮頸癌惡性程度、臨床進展及預后的相關性，對于國內(nèi)宮頸癌和p53基因的研究和臨床上推廣使用具有重大意義。

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