尹大全 袁暉 黃君勤

（上海新亞藥業(yè)有限公司 上海 201203）

硫酸黏菌素，又名硫酸抗敵素或多黏菌素E硫酸鹽，是一種由多種氨基酸和脂肪酸所組成的堿性多肽類抗生素。其作用原理是與細(xì)胞膜黏附，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)使之通透性變強(qiáng)，細(xì)胞因吸收周圍環(huán)境過多的水分而膨脹死亡。由于其具有腎毒性和神經(jīng)毒性，在過去的幾十年內(nèi)臨床上使用較少。而近幾年里，隨著“超級耐藥菌”，臨床治療面臨嚴(yán)重威脅，老的抗菌藥物硫酸黏菌素和多黏菌素B被再次啟用，作為治療泛耐藥性革蘭陰性桿菌感染的最后選擇[1]。

多黏菌素是從多黏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化獲得的多肽類抗生素，由于不同菌種所產(chǎn)生的多黏菌素所含氨基酸不同，共有A、B、C、D、E五種多黏菌素，除C外，每一種均包含兩個主要組分，各種多黏菌素的差別只是在3，6和7位上的氨基酸殘基和氨基末端的脂肪酸不同。由于結(jié)構(gòu)相似，各種多黏菌素抗菌譜相似，對幾乎所有革蘭陰性桿菌均有殺菌作用，其中以多黏菌素B和E毒性最小、療效最高[2]。

本研究采用歐洲藥典7.0版中硫酸黏菌素[3]有關(guān)物質(zhì)測定方法，對本公司生產(chǎn)的硫酸黏菌素與歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品所含有效組分進(jìn)行了對比研究，并通過制備液相對不同的組分進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Phenomenex Gemini C18液 相 色 譜 柱（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；Waters 2767/2545型制備液相色譜儀，Phenomenex Luna C18制備色譜柱（21.2 mm×250 mm, 5 μm）；Varian 500兆核磁共振儀；液質(zhì)聯(lián)用LC（Agilent）-MS（API150EX）。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；無水硫酸鈉（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品（EP，批號：002UO2）；硫酸黏菌素（上海新亞藥業(yè)有限公司，批號：1205301，1205302，1205303）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多黏菌素E組分對比

根據(jù)EP7.0版中硫酸黏菌素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所述，硫酸黏菌素中含有5種有效組分，分別為多黏菌素E1、E2、E3、E1-I、E1-7MOA（圖1）。取本公司產(chǎn)品及EP標(biāo)準(zhǔn)品，分別照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)方法測定，結(jié)果顯示本公司三批樣品與EP標(biāo)準(zhǔn)品除保留時間約為15.7 min增加了一個色譜峰外，其他組分基本一致（圖2）。

圖1 硫酸黏菌素結(jié)構(gòu)圖

圖2 硫酸黏菌素組分HPLC色譜圖

2.2 目標(biāo)組分的分離純化

取硫酸黏菌素樣品（批號：1205301，50 g），經(jīng)高壓制備液相分離，分別收集不同保留時間段的流份，經(jīng)C18柱脫鹽，TFA水洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥，得到保留時間為15.7 min的目標(biāo)組分。該物質(zhì)為白色粉末，易溶于甲醇和水，HPLC測得其純度在98%以上（圖3）。

2.3 目標(biāo)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)確證

2.3.1 核磁共振（1H-NMR，13C-NMR）

測試單位：中科院上海藥物研究所。

測定條件：D2O為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，室溫（23℃）。測定數(shù)據(jù)和解析如下（表1）。

表1 碳譜數(shù)據(jù)、氫譜數(shù)據(jù)和多鍵碳?xì)潢P(guān)系解析

（續(xù)表1）

1H-NMR顯示7.0～7.5 ppm可見有5個芳質(zhì)子，提示有一取代的苯環(huán)。δ0.5-1.2 ppm顯示有6個甲基峰，且為d峰，提示有-CH(CH3)2。δ4.05-4.42 ppm區(qū)域顯示有12個次甲基峰，符合硫酸黏菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)中環(huán)肽的10個氨基酸連接位(-NH-CH-CO-)上的-CH，同時還提示有2個蘇氨酸中的-CH(OH)CH3。結(jié)合H-HCOSY,ROESY譜對上述氫譜中的質(zhì)子進(jìn)行了歸屬，與文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道多黏菌素B2的化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。

13C-NMR中顯示有關(guān)物質(zhì)中有55個碳，DEPT譜顯示有12個季碳，19個CH，18個CH2，6個CH3，其中19個CH根據(jù)化學(xué)位移結(jié)合1H-NMR、HMQC和HMBC可分別歸屬為氨基酸連接位上的C有10個，芳環(huán)上有5個CH，及2個末端甲基上CH，2個蘇氨酸上-CH(OH)-CH3。

12個季碳中11個為羰基上的碳，1個為苯丙氨酸中苯環(huán)上的碳；18個-CH2中12個為L-Dab氨基酸，4個為6-MHA上的-CH2，1個為D-Phe上的CH2，1個為L-Leu上的-CH2；6個甲基碳分別為FA上的2個末端甲基，亮氨酸上的2個末端甲基，2個蘇氨酸上的末端甲基。

13C-NMR譜中，各C的歸屬及與相應(yīng)H的相關(guān)關(guān)系、遠(yuǎn)程相關(guān)關(guān)系均作了解析，具體歸屬及數(shù)據(jù)見表1。

通過1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC和HMBC譜，基本確證了目標(biāo)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的多黏菌素B2一致。

2.3.2 質(zhì)譜（LC-MS）

測試單位：中科院上海藥物研究所。測定數(shù)據(jù)和解析如下。

高分辨質(zhì)譜顯示（m/z）（M+H）+，1189.7411，分子式為C55H97N16O13，理論計(jì)算值為1189.7416，誤差為0.05。ESI-MS譜顯示準(zhǔn)分子離子峰(m/z)為1190，[M+2H]2+為596，[M+Na]為1212，MS/MS顯示1172為脫去H2O的離子（M+H-18）。963(1190-227)，863(963-100)，762(863-101)和662(762-100)，以上顯示氨基酸的裂解規(guī)律，與文獻(xiàn)報(bào)道的多黏菌素B2一致，質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 多黏菌素B2 ESI/MS/MS質(zhì)譜裂解途徑

綜上所述，通過NMR和MS譜的解析，高分辨質(zhì)譜給出的分子量及分子式均與文獻(xiàn)報(bào)道的多黏菌素B2一致，故本公司硫酸黏菌素中分離純化獲得的組分鑒定為已知的多黏菌素B2（圖5）。

圖5 多黏菌素B2的結(jié)構(gòu)

3 討論

硫酸黏菌素是由多黏芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種堿性高分子多肽化合物，其組分較為復(fù)雜，不同的菌種、培養(yǎng)條件和分離純化方法都可能導(dǎo)致其組分有一定的差別。EP硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品中有效成分為E1、E2、E3、E1-I和E1-7MOA，其中E1和E2為主要成分；實(shí)驗(yàn)研究表明，我公司產(chǎn)品的組分除上述成分外，還包含有B2。目前我公司將此組分作為雜質(zhì)來控制，限度為3.0%，但該組分同樣也是多黏菌素B中有效抗菌活性成分之一，其原料和注射劑在中國藥典、歐洲藥典和美國藥典中均有收載。

致謝

特別感謝上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司的蔡金娜博士對以上圖譜解析工作提供的技術(shù)幫助。

[1] 李然, 王睿, 李碧艷. 多粘菌素對泛耐藥革蘭陰性桿菌嚴(yán)重感染臨床應(yīng)用新進(jìn)展[J]. 中國藥物應(yīng)用與檢測, 2009,6(6): 364-367.

[2] 俞文和, 楊紀(jì)根. 抗生素工藝學(xué)[M]. 沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社, 1988: 333-336.

[3] European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia 7.0[EB/OL]. [2013-05-28]. http://db.yaozh.com/foreign/EP7.0/0320E.pdf

[4] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of polymyxin B components[J]. J Chromatogr A, 2001, 912(2): 369-373.

[5] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of colistin components[J]. J Antibiot, 2001,54(7): 595-599.