郭立姝，于麗萍，殷 博，曹亞彬，吳皓瓊，牛彥波，甄 濤，黨阿麗

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

基于硫桿菌能夠氧化硫生成硫酸的特性，其在工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，如濕法冶金、重金屬回收、煤炭脫硫［1－6］等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，也有一些研究報(bào)道［7］，使用硫粉和一些富含磷鉀的礦石粉與有機(jī)物料一起進(jìn)行堆肥，利用自然存在的硫桿菌的作用，顯著降低了堆肥物料的pH值，提高了堆肥中的有效磷、有效鉀的含量，提高了堆肥的質(zhì)量。張靜、楊清等［8］研究了硫桿菌在不同類型鹽堿土壤中的應(yīng)用，研究結(jié)果表明了其對(duì)降低土壤pH有明顯作用，處理的幾種土壤其pH有不同程度的降低。趙曉進(jìn)、李亞芳等［9］使用硫磺粉進(jìn)行改良鹽堿地的研究也是基于硫桿菌的作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，使用硫粉處理種植棉花的土壤，降低了土壤的pH，改善了土壤的養(yǎng)分狀況，促進(jìn)了棉花植株的生長(zhǎng)。吳曦、陳明昌等［10］使用硫磺處理種植油菜的堿性土壤，顯著降低土壤的pH值，增加土壤有效磷含量。與對(duì)照相比，施硫磺后土壤pH值最大降幅為0.5個(gè)單位;當(dāng)硫磺用量為120 mg/kg時(shí)土壤有效磷含量最高，比對(duì)照增加了68.6%。同時(shí)施用硫磺能增加油菜植株生物量，降低油菜植株體內(nèi)硝酸鹽含量，提高硝酸還原酶的活性和植株吸磷量，與對(duì)照相比，油菜植株生物量最大增加了29.64%，植株體內(nèi)硝酸鹽含量降低了58.6%，硝酸還原酶活性提高了近1.8倍，吸磷量增加了1.55倍。這些研究結(jié)果證明了硫桿菌在改良?jí)A性土壤方面的應(yīng)用效果和潛力，為此，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上［11］，針對(duì)自行分離選育的氧化硫硫桿菌TT03進(jìn)行轉(zhuǎn)化單質(zhì)硫的研究，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料:嗜酸性氧化硫硫桿菌TT03(Acidithiobacillus thiooxidans)為研制單位自行分離鑒定。堿斑土壤取自肇東市西4公里的公路收費(fèi)站附近;堿性耕作土壤取自肇東市宋站鎮(zhèn)附近農(nóng)田。

表1 TT03對(duì)堿斑土壤影響的試驗(yàn)方案Tab.1 The test scheme on effect of TT03 on highly alkaline soil

1.1.2 培養(yǎng)基:史塔克培養(yǎng)基［13］組成:2g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.5gMgSO4·7H2O、0.25 gCaCl2、10gS、水 1 000mL、pH4.0;制備:除硫粉外，其他成分溶解水中，在0.8kgf/cm2下滅菌30min;硫磺粉隔水常壓滅菌，使用前加入培養(yǎng)基中。固體史塔克培養(yǎng)基補(bǔ)加20g水洗瓊脂，以10gNa2S2O3替代硫磺粉，過(guò)濾方式除菌，使用前加入培養(yǎng)基中。

表2 TT03對(duì)堿性耕作土壤影響的試驗(yàn)方案Tab.2 The test scheme on effects of TT03 on alkaline soil

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備:在史塔克液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TT03菌液，在低溫高速離心機(jī)中離心，收集菌體，再以無(wú)菌生理鹽水洗滌1～2次至pH到中性為止，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至原體積，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氧化硫硫桿菌TT03對(duì)堿斑土壤作用的試驗(yàn)方法:土壤風(fēng)干細(xì)化后與硫粉混合均勻，再加入菌液及水，使土壤潮濕而不滲水為止，待處理的土樣分別裝入小花盆中，每盆500g。至培養(yǎng)室中培養(yǎng)，白天升溫至25℃以上，夜間自然溫度，過(guò)程中定期補(bǔ)充水以保持土壤濕潤(rùn)。具體的處理方法見(jiàn)表1。

圖1 TT03及硫粉處理堿斑土壤的pH變化過(guò)程Fig.1 The change of pH in alkaline soil after processed by TT03 and the sulfur

1.2.3 氧化硫硫桿菌TT03對(duì)堿性耕作土壤作用的試驗(yàn)方法:稱取5kg的堿性耕作土壤，其原始pH為8.27，加入單質(zhì)硫粉0.5g，液體菌劑15mL，混合均勻后，平鋪到帶孔塑料板上，土層厚度為30cm，均勻噴水，在保濕培養(yǎng)箱放置，室溫在28℃，處理期間視水分情況補(bǔ)充水分，以保證土壤的潮濕狀態(tài)(水分控制在15% ～25%)。在此條件下處理，定期取樣測(cè)定。試驗(yàn)以不加菌劑為對(duì)照處理。

1.2.4 采用酸堿滴定法測(cè)定酸度，以硫酸含量表示;采用沉淀法測(cè)定硫酸根含量;采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮;采用碳酸氫鈉法測(cè)定速效磷;采用醋酸銨浸提法測(cè)定速效鉀;pH采用電位儀法測(cè)定;重碳酸鹽采用雙指示劑滴定法測(cè)定［12－13］。固氮作用強(qiáng)度、硝化作用強(qiáng)度、氨化作用強(qiáng)度、磷轉(zhuǎn)化強(qiáng)度、酚降解強(qiáng)度、土壤呼吸強(qiáng)度的測(cè)定參考“土壤酶及其研究法”［14］進(jìn)行。

1.2.5 計(jì)算方法:液體中單質(zhì)硫粉的轉(zhuǎn)化率以實(shí)際培養(yǎng)TT03后產(chǎn)生的硫酸量與加入單質(zhì)硫粉按理論被完全轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的硫酸量的百分比表示。土壤中單質(zhì)硫粉的轉(zhuǎn)化率以實(shí)際培養(yǎng)TT03后產(chǎn)生的硫酸根含量與加入單質(zhì)硫粉按理論被完全轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的硫酸根的百分比表示。

表3 TT03與硫粉處理后堿斑土壤的主要成分含量變化 mg/gTab.3 The change of primary nutrient in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2 結(jié)果

2.1 TT03及硫粉對(duì)堿斑土壤的作用

利用TT03及硫粉處理堿斑土壤過(guò)程中，空白處理(對(duì)照2)與菌懸液處理(對(duì)照1)的pH變化不明顯，代表了土壤的自然狀態(tài)。外源的菌懸液與硫粉進(jìn)入土壤后，土壤的性狀發(fā)生改變。隨菌懸液與硫粉用量的提高，pH的下降幅度與速度皆有顯著的提高(圖1)，以處理3的效果最為明顯，處理結(jié)束時(shí)pH由初始的10.03下降到8.78，pH下降幅度為1.25。除了pH的變化以外，堿斑土壤的內(nèi)部性狀也發(fā)生改變，重碳酸鹽有較大幅度的下降，硫酸根含量猛增，速效磷含量顯著增加(表3)。綜合表中的結(jié)果，可以判定硫酸根上升、重碳酸鹽下降與速效磷增加三者之間是緊密相關(guān)的。TT03及硫粉處理堿斑土壤也引起土壤微生物活動(dòng)的變化(表4)，除固氮強(qiáng)度沒(méi)有明顯的變化以外，其他的生化指標(biāo)皆向著有利于農(nóng)作物生長(zhǎng)的方向改變，體現(xiàn)出了TT03及硫粉處理堿斑土壤的效果。

表4 TT03與硫粉處理后堿斑土壤的生化指標(biāo)變化Tab.4 The change of biochemical function in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2.2 TT03對(duì)堿性耕作土壤的作用

以堿性耕作土壤、硫粉、TT03菌液及水組成基本培養(yǎng)物料(表2)，在相同的條件下培養(yǎng)，其試驗(yàn)的結(jié)果列于圖2中。在試驗(yàn)期內(nèi)，對(duì)照1的硫酸根含量微有上升，基本與未處理前相同;對(duì)照2的硫酸根含量逐漸而緩慢的升高，培養(yǎng)到第63d時(shí)pH下降到8.11，硫酸根含量由原始樣品的18.2mg/kg上升到64.6mg/kg，提高了3.55 倍，表明即使在堿性土壤中，仍然有土著的硫桿菌存在;處理樣品的硫酸根含量在7d后開(kāi)始迅猛增長(zhǎng)，28d時(shí)pH為7.94，硫酸根含量達(dá)到187.4mg/kg，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率達(dá)56.4%，隨后增長(zhǎng)趨于緩慢，在培養(yǎng)至63d時(shí)，pH為7.73，硫酸根含量上升到232.3mg/kg，是初始含量的12.76倍，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率達(dá)71.4%。在同等條件下，添加TT03菌劑處理相比于不添加TT03菌劑的對(duì)照2，在培養(yǎng)到63d時(shí)，轉(zhuǎn)化單質(zhì)硫生成硫酸根的量提高了3.59倍，試驗(yàn)結(jié)果表明外源添加氧化硫硫桿菌對(duì)堿性土壤中單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化有顯著促進(jìn)作用。

圖2 TT03在堿性土壤中對(duì)硫的轉(zhuǎn)化Fig.2 The sulfur changed by TT03 in alkaline soil

堿性土壤中外源加入TT03菌劑與硫粉，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)處理，生成的硫酸改變了土壤的性狀(表5)。

表5 TT03與硫粉處理后堿性土壤營(yíng)養(yǎng)成分的變化Tab.5 The change of primary nutrient in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

首先土壤的pH明顯下降，經(jīng)過(guò)28d與63d的處理，pH分別下降到7.94與7.73;同時(shí)由于土壤pH下降，使得土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被更有效地溶出，土壤的速效養(yǎng)分明顯提高，水解性氮由培養(yǎng)前的20.13 mg/kg分別提高到21.22 mg/kg與 22.65 mg/kg，分別增加到原值的 105.36% 與112.51%;速效磷由培養(yǎng)前的12.11 mg/kg分別提高到18.18 mg/kg、32.45 mg/kg，分 別 增 加 到 原 值 的 為150.12%、178.49%;速效鉀由培養(yǎng)前的 79.6mg/kg 分別提高到132.45 mg/kg、178.24 mg/kg，分別增加到原值的166.39%、223.91%;相比較而言，有效磷、有效鉀的增幅效果遠(yuǎn)高于水解氮，這是由于土壤中氮磷鉀的存在形式不同及硫酸對(duì)它們的溶出效果不同而造成的結(jié)果。由于單質(zhì)硫被氧化成硫酸，土壤中硫酸根的含量大幅度上升，與完全空白對(duì)照與單施硫粉對(duì)照相比，處理28d時(shí)硫酸根含量分別提高4.5倍與9.9倍，處理63d時(shí)，硫酸根含量分別提高3.6倍與10.4倍;同時(shí)由于酸堿中和作用，土壤中的部分重碳酸鹽被轉(zhuǎn)化為二氧化碳而排放，其含量下降，在培養(yǎng)到28d與63d時(shí)，由初始的766.5 mg/kg分別下降到650.4 mg/kg與605.3 mg/kg(表6)。

表6 TT03與硫粉處理后堿性耕作土壤pH與硫酸根的變化Tab.6 The change of pH and sulfate ions in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

3 討論

氧化硫硫桿菌TT03對(duì)硫的氧化取于其生存的環(huán)境與硫的供給，在其能耐受的pH環(huán)境下，對(duì)硫的氧化能夠持續(xù)進(jìn)行。在堿性土壤中，環(huán)境土壤呈堿性，TT03仍能生長(zhǎng)，可能是由于堿性土壤的總體環(huán)境與微環(huán)境之間的差異造成，在微觀環(huán)境下，某些土壤顆粒的環(huán)境條件及外源加入的硫粉顆粒會(huì)滿足TT03的生長(zhǎng)要求，并且隨TT03生長(zhǎng)產(chǎn)酸，微觀環(huán)境的改變會(huì)進(jìn)一步有利于其生長(zhǎng)。TT03對(duì)土壤速效營(yíng)養(yǎng)的影響是明顯的，速效磷、速效鉀的大幅度提高是土壤向酸性變化的具體體現(xiàn)，酸性條件更有利于一些難溶性磷或鉀化合物的溶解。研究對(duì)TT03用于堿性土壤改良僅進(jìn)行了初步的探索，結(jié)果表明了TT03在此方面的效果與潛力，更多的問(wèn)題將在今后的工作中深入研究。

［1］楊顯萬(wàn)，邱定蕃.濕法冶金［M］.北京:冶金工業(yè)出版社，1997.

［2］吳為榮，鄭志宏.氧化硫硫桿菌的耐氟馴化試驗(yàn)研究［J］.有色金屬(冶煉部分)，2007，(3):38－40.

［3］孫艷，吳鋒.硫桿菌浸出廢舊MH/Ni電池中重金屬研究［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16(6):1674 －1678.

［4］黃峰源，王世梅.氧化硫硫桿菌TS6的生長(zhǎng)條件及其對(duì)重金屬耐受性［J］.研究環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26(8):1290 －1294.

［5］張悅秋，謝廣元.氧化硫硫桿菌氮代謝及其對(duì)煤炭脫硫影響的研究［J］.潔凈煤技術(shù)，2007，13(4):32－34.

［6］何鋒，周立祥，王電站.利用嗜酸性硫桿菌的生物產(chǎn)酸作用處理洗毛廢水［J］.環(huán)境科學(xué)，2007，28(2):382 －386.

［7］鄭士民.自養(yǎng)微生物［M］.北京:科學(xué)出版社，1983.

［8］張靜，王清.利用硫氧化細(xì)菌改良鹽堿土［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(地球科學(xué)版)，2009，39(1):147 －151.

［9］趙曉進(jìn)，李亞芳.硫磺改良鹽漬土效果初探［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26(4):74 －78.

［10］吳曦，陳明昌.堿性土壤施硫磺對(duì)油菜生長(zhǎng)、土壤pH和有效磷含量的影響［J］.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2007，13(4):671－677.

［11］郭立姝，殷博，曹亞彬，吳皓瓊.用于鹽堿土壤處理的氧化硫硫桿菌的選育及鑒定［J］.生物技術(shù)，2010，20(6):61 －63.

［12］張行峰.實(shí)用農(nóng)化分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［13］鮑士旦.土壤農(nóng)化分析［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［14］關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1986.