谷燕燕，耿偉濤，宋存江

南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子微生物與技術(shù)教育部重點實驗室，天津 300071

鏈霉菌Streptomyces是革蘭氏陽性菌 (G+)，屬于放線菌目 (Actinomycetes)鏈霉菌屬，由于其能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，因此在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的作用。鏈霉菌在工業(yè)生產(chǎn)中主要用于抗生素的生產(chǎn)，目前許多天然來源的臨床使用抗生素都是由鏈霉菌生產(chǎn)，如鏈霉素[1]、四環(huán)素、新霉素和氯霉素等[2]。另外鏈霉菌還用于生產(chǎn)其他產(chǎn)物如免疫抑制劑、抗腫瘤劑、抗蟲劑及胞外水解酶，如蛋白酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶等[3]。由于其在工業(yè)上的重要作用，鏈霉菌遺傳、發(fā)育及代謝調(diào)控的研究一直備受重視。

隨著科技的發(fā)展，發(fā)酵工業(yè)與生物催化向人們提出了更高的要求，進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、純度及開發(fā)有價值新化合物等成為工業(yè)生產(chǎn)急需解決的問題[4]。如何更快、更有效地對菌種進(jìn)行改造，獲得高產(chǎn)、高純產(chǎn)物菌株成為我們研究的主要目標(biāo)。應(yīng)用傳統(tǒng)的育種手段不但效率低、工作量大，而且獲得的菌株遺傳穩(wěn)定性較差[5]。近年來隨著分子生物學(xué)和基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展以及合成生物學(xué)概念的提出[6]，使人們能夠利用已有的基因組信息和分子生物學(xué)方法目標(biāo)明確地對目標(biāo)菌株進(jìn)行改造。我們一方面可以利用基因敲除技術(shù)阻斷其他細(xì)胞代謝旁路來提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量；另一方面還可以通過基因敲除或者基因修飾獲得新的代謝產(chǎn)物從而達(dá)到微生物定向育種的目的[7]。此方法具有靶向性、安全性和穩(wěn)定性的特點，逐漸成為發(fā)酵工業(yè)育種的重要手段。

1 鏈霉菌基因組基本特點

在眾多的鏈霉菌菌株中，天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyce coelicolor是第一個完成全基因組測序的鏈霉菌，也是目前研究鏈霉菌遺傳分化和抗生素生產(chǎn)的最好模式菌株[8]。目前已完成測序的鏈霉菌還有灰色鏈霉菌Streptomyce griseus[9]、阿維鏈霉菌Streptomyce avermitilis[10]等。鏈霉菌的染色體基因組呈線狀，具有較高的GC含量，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是目前已知的基因組最大的原核生物。其染色體中有一大小約6.28～6.5 Mb的核心區(qū)域，包含了鏈霉菌生長所必需的基因；線性染色體的兩端均有長度大約1 Mb的亞端粒區(qū)，該區(qū)包含特殊的應(yīng)變基因和次生代謝途徑相關(guān)基因，如圖1中所示S.griseus染色體示意圖。同時鏈霉菌染色體的末端存在著大量反向重復(fù)序列，其在鏈霉菌發(fā)育過程中會缺失、擴增甚至環(huán)化，從而造成鏈霉菌染色體末端的不穩(wěn)定[11]。

根據(jù)已有的鏈霉菌基因組測序結(jié)果分析顯示，鏈霉菌體內(nèi)編碼天然產(chǎn)物生物合成途徑的基因簇比己知的天然產(chǎn)物的基因簇多，這意味著鏈霉菌中許多的次生代謝產(chǎn)物未被發(fā)現(xiàn)，將其稱為“隱蔽的”(Cryptic)基因簇，如圖1(II)中的黑色條帶，這是由于在實驗室條件下只有少數(shù)的生物合成途徑基因表達(dá)[12]。因此，可以通過有效的分子操作方法來對鏈霉菌基因組進(jìn)行精簡或?qū)Α半[蔽的”基因簇進(jìn)行功能分析，以發(fā)揮鏈霉菌在生產(chǎn)發(fā)展中的巨大潛力。文中綜述了近年來在鏈霉菌中應(yīng)用的分子操作方法并重點對鏈霉菌的無痕敲除方法進(jìn)行總結(jié)分析。

圖1 S.griseus染色體示意圖[9]Fig.1 Schematic representation of the S.griseus chromosome[9].(I)The yellow color indicates the “core region”.(II)Distribution of secondary metabolite gene clusters.Red:streptomycin(str,sts);blue:grixazone(gri);green:PKS and/or NRPS;black:other[9].

2 鏈霉菌有痕敲除方法

研究基因中斷/敲除突變株的表型變化是一種廣泛使用的研究功能未知基因的方法。鏈霉菌的有痕敲除方法是最早研究的一種基因敲除方法。由于在鏈霉菌中依賴于同源重組的基因敲除效率極低，當(dāng)上下游同源臂小于1 kb時，幾乎篩選不到雙交換的目的菌株[13]。Gust等[14]將λ-red重組系統(tǒng)應(yīng)用于構(gòu)建鏈霉菌敲除載體，其構(gòu)建過程如圖 2。在含有λ-red重組系統(tǒng)的大腸桿菌Escherichia coliBW25113中，λ-red重組系統(tǒng)促進(jìn)側(cè)翼含有同源臂的抗性表達(dá)盒PCR擴增片段和含有鏈霉菌基因的粘粒發(fā)生同源重組，將得到的重組質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入S.coelicolor中。由于其敲除載體的兩端含有大片段的同源臂，重組粘粒和染色體之間可發(fā)生更高效的同源重組。但得到的目的菌株染色體上含有抗性篩選標(biāo)記，不利于進(jìn)行連續(xù)敲除。

圖2 應(yīng)用λ-red重組系統(tǒng)構(gòu)建敲除載體[14]Fig.2 Construction of knockout vector based on λ-red recombination system[14].

3 鏈霉菌的無痕敲除方法

鏈霉菌有痕敲除方法的缺點是每次敲除基因之后都會在染色體基因組上引入一個篩選標(biāo)記，因此進(jìn)行連續(xù)敲除時多種抗性標(biāo)記在同一株菌內(nèi)的疊加使用使得其后抗性標(biāo)記的選擇越發(fā)困難，而且抗性基因的插入還會影響其上下游基因的表達(dá)[15]。因此如何通過無痕敲除的方法對鏈霉菌進(jìn)行基因操作成為人們研究的重點。

3.1 位點特異性重組

在后基因組時代，位點特異性重組系統(tǒng)已經(jīng)成為高通量遺傳分析中有利和高效的手段，在許多細(xì)菌和高等生物中已得到了廣泛的應(yīng)用[16]。位點特異性重組技術(shù)是通過對DNA的特定序列進(jìn)行準(zhǔn)確切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對生物進(jìn)行改造的一種技術(shù)。利用位點特異性重組技術(shù)能夠進(jìn)行基因的定點插入[17]、外源基因的無痕表達(dá)[18]、基因的瞬態(tài)或定時的表達(dá)[19]和大片段敲除菌株的構(gòu)建[20]等操作。目前在鏈霉菌中已得到應(yīng)用的位點特異性重組系統(tǒng)有Cre/loxp系統(tǒng)、Dre/rox系統(tǒng)、Flp/FRT系統(tǒng)和Int-Xis系統(tǒng) (表1)。下面將詳細(xì)介紹應(yīng)用不同的位點特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建無痕敲除突變株的方法。

3.1.1 Cre/loxp系統(tǒng)

Cre重組酶是1981年在P1噬菌體Phage P1中發(fā)現(xiàn)的一種重組酶，屬于Int家族。Cre重組酶基因序列全長1 029 bp，蛋白大小為38 kDa。它能介導(dǎo)2個loxp位點之間的特異性重組，將2個loxp位點間的基因刪除或倒位。loxp位點是Cre重組酶的特異性識別位點，是一段回文序列，由34 bp組成，即：2個13 bp的反向重復(fù)序列和1個8 bp的不對稱間隔區(qū)[21]。

2006年，Khodakaramian等[25]將Cre重組酶在S.coelicolorA3(2)中成功表達(dá)，抗性基因的刪除率達(dá)60%～90%。但是，由于Cre重組酶是通過ФC31噬菌體的轉(zhuǎn)染進(jìn)入鏈霉菌中，因此該方法未得到廣泛的應(yīng)用。Fedoryshyn等[26]在2008年對cre基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，合成了GC含量達(dá)67.7%的cre(a)基因，并使其在變鉛青鏈霉菌Streptomyc lividans中以質(zhì)粒形式成功地進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗性基因的刪除率可達(dá)100%。之前抗性基因敲除的研究多是應(yīng)用該方法進(jìn)行。

近年來，Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)被逐漸應(yīng)用于鏈霉菌的大片段無痕敲除。Komatsu等[27]應(yīng)用Cre/loxp系統(tǒng)對S.avermitilis的基因組進(jìn)行了精簡，并且得到了一次敲除缺失 1.4 Mb的敲除突變株。在該方法中，2個loxp位點分別通過同源重組的方法整合到敲除基因的上下游，含有Cre重組酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pKU471通過接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入S.avermitilis中，在Cre重組酶的作用下，在2個loxp位點之間發(fā)生同源重組，最終完成靶序列的敲除，其敲除過程見圖3。

表1 鏈霉菌中應(yīng)用的位點特異性重組系統(tǒng)分類[21-24]Table 1 Classification of Site-specific recombination system in Streptomyces[21-24]

圖3 Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建無痕敲除突變株原理示意圖[27]Fig.3 Strategy for construction of unmarked mutants based on Cre/loxp specific recombination system[27].

Herrmann等[28]對其敲除方法進(jìn)行了改進(jìn)，其敲除過程見圖4。作者首先將2個loxp位點通過單交換的方法依次整合到敲除基因的上下游，在Cre重組酶的作用下將2個loxp位點間的靶基因刪除，其敲除率可達(dá)100%。此方法和上述方法相比，其優(yōu)點在于：此方法是通過單交換將loxp位點插入到靶基因的上下游，相較于雙交換而言，單交換更容易獲得。作者應(yīng)用此方法分別將金色鏈霉菌Streptomyce aureofaciensTü117、鏈霉菌Streptomycessp.Tü6071和肉桂地鏈霉菌StreptomycecinnamonensisA519中的phenalinolactone(38 kb)、α-脂酶素 (67 kb)和莫能菌素 (83 kb)的合成酶基因簇進(jìn)行了敲除，3株敲除突變株均不能產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

應(yīng)用Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)的缺點是每進(jìn)行一次敲除之后染色體上會留下1個loxp位點，連續(xù)進(jìn)行多次敲除后會造成染色體的不穩(wěn)定。為了維持染色體的穩(wěn)定性，含有不同突變的lox位點 (loxLE和loxRE)的Cre/loxp系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于真核微生物和細(xì)菌的敲除研究中[29]。理論上loxLE和loxRE重組后形成雙突變的loxLERE位點，利用Cre重組酶不能很好地識別雙突變的loxLERE位點的特性，因此可以在同一株菌中進(jìn)行多次敲除。但是Herrmann等[28]發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌中Cre重組酶對雙突變的loxLERE位點仍有較好的識別能力，因此在鏈霉菌中即使使用Cre/loxLE-loxRE系統(tǒng)，仍然存在很高的染色體重組風(fēng)險。

3.1.2 Flp/FRT系統(tǒng)

與Cre-loxP系統(tǒng)相似，F(xiàn)lp-FRT系統(tǒng)也是由一個重組酶和一段特殊的DNA序列組成。Flp重組酶基因全長1 272 bp，編碼1個由423個氨基酸殘基組成的多肽單體蛋白，該系統(tǒng)的另1個元件Flp識別位點 (Flp recognition target，F(xiàn)RT)與loxP位點也非常相似，同樣由2個長度為13 bp的反向重復(fù)序列和1個長度為8 bp的核心序列構(gòu)成。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時，2個FRT位點的方向性決定了目的片段的缺失或是倒轉(zhuǎn)。與Cre相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性[22]。

由于flp基因GC含量太低，無法在鏈霉菌中表達(dá)來進(jìn)行位點特異性重組，Gust等[14]巧妙地將Flp-FRT位點特異性重組系統(tǒng)和λ-red重組系統(tǒng)結(jié)合在一起來對鏈霉菌的基因進(jìn)行敲除。作者將該方法命名為PCR-Targeting(圖5)。

圖4 改進(jìn)后的Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建無痕敲除突變株原理示意圖[28]Fig.4 Strategy for construction of unmarked mutants based on improved Cre/loxp specific recombination system[28].

文章中作者應(yīng)用PCR-Targeting方法來分析在S.coelicolorA3(2)中土味素生物合成所必需的基因。首先通過序列比對發(fā)現(xiàn)S.coelicolorA3(2)含有兩個倍半萜烯合酶基因——cyc1和cyc2，然后用該方法將二者分別框內(nèi)敲除后發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除cyc2時，將不產(chǎn)生土味素。對cyc2編碼的蛋白分析發(fā)現(xiàn)：Cyc2含有兩個相似的倍半萜烯合酶結(jié)構(gòu)域。為了驗證該兩個結(jié)構(gòu)域是否都是土味素生物合成所必需的結(jié)構(gòu)域，作者分別對Cyc2的C端和N端進(jìn)行了框內(nèi)敲除。結(jié)果表明只有Cyc2的N端是土味素合成所必需的基因。成功地應(yīng)用PCR-Targeting方法將S.coelicolor基因組中大小為4～7 kb的100多個片段進(jìn)行敲除。

圖5 PCR-Targeting構(gòu)建無痕敲除突變株原理示意圖[14]Fig.5 Strategy for construction of unmarked mutants utilizing PCR-Targeting[14].

2008年，F(xiàn)edoryshyn等[30]合成 GC含量達(dá)60.6%的flp基因，其能在S.coelicolorM145、S.lividansTK24和西班牙糖絲菌Saccharothrix espanaensis中表達(dá)。然而，其將染色體上兩邊含有FRT位點的阿伯拉霉素抗性基因的刪除率僅達(dá)40%，效率要遠(yuǎn)低于Cre/loxp系統(tǒng)的效率。該方法雖然效率相對較低，但還是可以相對容易地獲得無痕敲除突變株。

3.1.3 Dre/rox系統(tǒng)

2004年，Sauer和 McDermott[23]對 4株 P1相關(guān)噬菌體 (P7噬菌體Phage P7、p15B缺陷噬菌體 Defective phage p15B、ψw39轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體Transducing phage ψw39和 D6轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體Transducing phage D6)的7 kb immc區(qū)進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)了1個新的DNA重組酶——Dre。D6位點特異性重組酶 (Dre)和Cre重組酶相似均是酪氨酸重組酶，但其識別的是32 bp的DNA序列rox。Dre重組酶和Cre重組酶具有異種特異性，Dre重組酶不能識別loxp位點，同時Cre重組酶也不能識別rox位點。

為使Dre重組酶在鏈霉菌中進(jìn)行表達(dá)，Herrmann等[28]將其編碼基因的 GC含量進(jìn)行優(yōu)化，基因合成后分別克隆到pAL1和pUWLoriT構(gòu)建成pALDRE和pUWLDRE。為研究Dre/rox系統(tǒng)的重組效率，作者分別在小單胞菌屬Micromonosporasp.Tü6368 、Saccharothrix espanaensis、S.coelicolorT3456-20和S.lividansTK24中進(jìn)行了抗性基因刪除試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同菌株中抗性基因刪除率均可達(dá)100%，說明Dre成功表達(dá)并且 Dre/rox系統(tǒng)有很高的重組效率，這就為放線菌的基因操作提供了新的工具——Dre/rox位點特異性重組系統(tǒng)。

3.1.4 Int/Xis系統(tǒng)

Raynal等[24]利用產(chǎn)二素鏈霉菌Streptomyces ambofaciens中原始質(zhì)粒pSAM2構(gòu)建了一種新型的鏈霉菌敲除體系——Int/Xis位點特異性重組系統(tǒng)。pSAM2為鏈霉菌整合質(zhì)粒，具有和溫和噬菌體位點特異性重組相似的系統(tǒng)，其編碼的復(fù)制酶、切除酶和整合酶基因repSA、xis和int是以操縱子的形式存在。整合酶促進(jìn)attP位點和attB位點間的重組，從而將外源片段整合到染色體上并且形成attL和attR位點。Int/Xis系統(tǒng)的基本原理是：當(dāng)整合酶和刪除酶同時表達(dá)時可以促進(jìn)attL位點和attR位點之間發(fā)生分子內(nèi)位點特異性重組，從而將兩位點間的序列刪除，達(dá)到敲除的目的。

作者首先構(gòu)建了一個attL-抗性基因-attR的基因盒和一系列含int和xis基因的表達(dá)載體(pSOV507和pSOV508)。兩端帶有EcoRV平末端內(nèi)切酶的attL-抗性基因-attR基因盒，可以平末端的形式插入到任何克隆基因中，其敲除載體及敲除過程見圖6。S.ambofaciens中螺旋霉素合成酶基因簇中含有7個ORF，編碼的酶參與了螺旋霉素生物合成的不同步驟。作者應(yīng)用該系統(tǒng)將S.ambofaciens中螺旋霉素合成酶基因簇中的ORF3進(jìn)行了框內(nèi)敲除。其具體操作過程如下：首先構(gòu)建了敲除載體pOSV513——用attL-hyg-attR的基因盒置換了ORF3中的270 bp核苷酸序列。然后將pOSV513導(dǎo)入S.ambofaciens，通過篩選雙交換得到S.ambofaciensorf3::att1_hyg菌株。最后將表達(dá)載體pSOV508導(dǎo)入上述菌株，表達(dá)Int和Xis促進(jìn)attL位點和attR位點之間發(fā)生特異性重組，將兩位點間的抗性基因刪除，在染色體上留下att1位點。

3.2 大范圍核酸內(nèi)切酶

同源重組是一種廣泛存在于微生物中的生物事件，涉及的分子事件是高度保守，包含了DNA的雙鏈斷裂和修復(fù)。以同源重組為基礎(chǔ)的分子操作方法是基因組工程的強大工具，它已廣泛應(yīng)用于不同生物中基因的敲除、替換或外源基因的插入。在天藍(lán)色鏈霉菌中已建立了各種遺傳工具，如常規(guī)的依賴于同源重組的基因破壞和基因替換以及更有效的PCR-targeting方法。然而，即使應(yīng)用PCR-targeting方法在天藍(lán)色鏈霉菌中獲得無痕突變?nèi)匀皇莻€費時的過程。

Rouet和Choulika等的研究發(fā)現(xiàn)在特定位點的雙鏈DNA斷裂可促進(jìn)同源重組發(fā)生的概率[31-32]。大范圍核酸內(nèi)切酶可造成 DNA的雙鏈斷裂，它能夠特異性識別＞12 bp的核苷酸序列。歸巢核酸內(nèi)切酶是大范圍核酸內(nèi)切酶的代表，參與內(nèi)含子歸巢的過程，廣泛存在于低等真核生物、細(xì)菌和古菌中[33]。類似于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，歸巢核酸內(nèi)切酶具有很高的序列特異性，但Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識別短核苷酸序列 (3～8 bp)，而歸巢內(nèi)切酶識別較長核苷酸序列 (12～40 bp)[34]。

3.2.1Ⅰ-SceⅠ大范圍核酸內(nèi)切酶

大范圍核酸內(nèi)切酶Ⅰ-SceⅠ是在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的線粒體中發(fā)現(xiàn)的，該核酸內(nèi)切酶含有235個氨基酸，識別18 bp核苷酸序列 (5′-TAGGGATAACAGGGTAAT-3′)[35-36]。理論上700億bp隨機序列可能出現(xiàn)1個18 bp識別序列，目前所分析的鏈霉菌基因組序列中未發(fā)現(xiàn)Ⅰ-SceⅠ識別位點，因此避免了基因組被大范圍核酸內(nèi)切酶破壞的風(fēng)險。Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶已被應(yīng)用為鏈霉菌染色體雙鏈斷裂的誘導(dǎo)劑，并且利用該系統(tǒng)證明了在鏈霉菌中同源重組是DNA雙鏈斷裂的主要修復(fù)機制[37]。應(yīng)用以Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的基因操作方法已成功在E.coli[38]，炭疽芽胞桿菌Bacillus anthracis[39]，類鼻疽伯克氏菌Burkholderia pseudomallei[40]，谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum[41]和銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[42]中構(gòu)建了缺失突變株。

圖6 Xis/Int位點特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建無痕敲除突變株原理示意圖[24]Fig.6 Strategy for construction of unmarked mutants based on Xis/Int specific recombination system[24].

由于原始的Ⅰ-SceⅠ編碼基因GC含量只有20%，無法在鏈霉菌中進(jìn)行表達(dá)。Siegl等[37]和Lu等[43]將其GC含量進(jìn)行優(yōu)化，最終的Ⅰ-SceⅠ編碼基因GC含量分別達(dá)56.6%和55.2%，合成后克隆到表達(dá)載體，形成表達(dá)載體pLU101、pALSCE和 pUWLSCE。Lu等應(yīng)用優(yōu)化后的Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶基因敲除方法將S.coelicolor中的放線紫紅素合成酶基因簇中約20 kb的片段進(jìn)行了敲除。首先構(gòu)建了含有靶基因上下游同源臂、抗性篩選標(biāo)記和1個Ⅰ-SceⅠ識別位點的自殺敲除質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到鏈霉菌中，并通過單交換整合到染色體上。隨后將含有Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到上述突變株中，Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶表達(dá)后識別18 bpⅠ-SceⅠ位點，并在該位點將雙鏈DNA切斷促使雙交換的發(fā)生。最后通過PCR檢測可很容易篩選到敲除突變株 (圖7)。該方法的優(yōu)點是效率高且Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶不僅能夠促進(jìn)同源重組而且是嵌合體的反向篩選標(biāo)記，同時得到的敲除突變株是無痕的，可以在同一株菌中連續(xù)進(jìn)行多次敲除實驗。

圖7Ⅰ-SceⅠ核酸內(nèi)切酶構(gòu)建無痕敲除突變株原理示意圖[37,43]Fig.7 Strategy for construction of unmarked mutants based on I-SceI endonuclease[37,43].

4 展望

鏈霉菌能產(chǎn)生大量的具有重要價值的天然代謝產(chǎn)物，因此鏈霉菌的遺傳發(fā)育與次級代謝領(lǐng)域的任何進(jìn)展都與人類生活息息相關(guān)。筆者所在研究室分離到1株可產(chǎn)ε-聚賴氨酸的小白色鏈霉菌Streptomyces albulusNK660[44]，正在進(jìn)行該菌株的全基因組測序。通過采用pUC19和pAL1質(zhì)粒，并結(jié)合Cre/loxp位點特異性重組的特性，構(gòu)建了適合S.albulusNK660菌株大片段無痕敲除的Cre/loxp方法。同時采用pUC19和pKC1139質(zhì)粒，結(jié)合Ⅰ-SceⅠ大范圍核酸內(nèi)切酶的特點，構(gòu)建了Ⅰ-SceⅠ的大片段無痕敲除方法。Cre/loxp和Ⅰ-SceⅠ的大片段無痕敲除原理示意圖見圖4和圖7。筆者期望通過構(gòu)建優(yōu)勢小基因組菌株來提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，減少其他次級代謝產(chǎn)物的含量并降低原料底物消耗量。相信隨著大片段無痕敲除鏈霉菌冗余基因方法的不斷完善，必將推進(jìn)鏈霉菌的基礎(chǔ)研究和相關(guān)次級代謝產(chǎn)物工業(yè)的發(fā)展。

[1]Schatz A,Bugie E,Waksman SA.Streptomycin,a substance exhibiting antibiotic activity against gram-positive and gram-negative bacteria.Proc Soc Exp Biol Med,1944,55:66?69.

[2]Wang S, Gao YL. Research progress of aminoglycoside drug.Pharm J Chin PLA,2009,25(4):329?333(in Chinese).

王舒,高永良.氨基糖苷類藥物研究新進(jìn)展.解放軍藥學(xué)學(xué)報,2009,25(4):329?333.

[3]Li O,Miao KP.Progress inStreptomycessecondary metabolism.Chin J Antibiotics,2005,30(11):695?698(in Chinese).

李歐,繆克排.鏈霉菌次級代謝研究進(jìn)展.中國抗生素雜志,2005,30(11):695?698.

[4]Zhang HY,Shen NK,Zhou X.Gene knockout technology and its application in microbial breeding. Liquor-Making Sci Technol, 2010,190(4):21?25(in Chinese).

張紅巖,申乃坤,周興.基因敲除技術(shù)及其在微生物育種中的應(yīng)用.釀酒科技,2010,190(4):21?25.

[5]Parekh S,Vinci VA,Strobel RJ.Improvement of microbial strains and fermentation processes.Appl Microbiol Biotechnol,2000,54(3):287?301.

[6]Heinemann M,Panke S.Synthetic biology-putting engineering into biology.Bioinformatics,2006,22(22):2790?2799.

[7]Song AD,Zhang SS,Wang FQ,et al.Gene knockout and its applications in industrial microbe breeding.J Biol,2011,28(6):68?72(in Chinese).

宋安東,張沙沙,王風(fēng)芹,等.基因敲除在工業(yè)微生物育種方面的應(yīng)用.生物學(xué)雜志,2011,28(6):68?72.

[8]Bentley SD,Chater KF,Challis GL,et al.Complete genome sequence ofthe modelactinomyceteStreptomycescoelicolorA3(2).Nature,2002,417(6885):1141?1147.

[9]Ohnishi Y,Ishikawa J,Hara H,et al.Genome sequence of the streptomycin-producing microorganismStreptomyces griseusIFO 13350.J Bacteriol,2008,190(11):4050?4060.

[10]Ikeda H,Ishikawa J,Hanamoto A,et al.Complete genomesequencecomparativeanalysisofthe industrial microorganismStreptomyces avermitilis.Nat Biotechnol,2003,21(5):526?531.

[11]Wu XC,Miao KP,Qian KX.Advances of genome and secondary metabolism inStreptomyces.Acta Genet Sin,2005,32(11):1221?1227(in Chinese).

吳雪昌,繆克排,錢凱先.鏈霉菌基因組及次生代謝研究進(jìn)展.遺傳學(xué)報,2005,32(11):1221?1227.

[12]Zhou M,Jing XY,Xie PF,et al.Sequential deletion of all the polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase biosynthetic gene clusters and a 900-kb subtelomeric sequence of the linear chromosome ofStreptomyces coelicolor.FEMS Microbiol Lett,2012,333(2):169?179.

[13]Kieser T,Bibb MJ,Buttner MJ,et al.PracticalStreptomycesGenetics.United Kingdom:the John Innes Foundation Press,2000:311?315.

[14]Gust B,Challis GL,Fowler K,et al.PCR-targetedStreptomycesgene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(4):1541?1546.

[15]Siegl T,Luzhetskyy A.Actinomycetes genome engineering approaches. Antonie Van Leeuwenhoek,2012,102(3):503?516.

[16]Branda CS,DymeckiSM.Talking abouta revolution:the impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.Dev Cell,2004,6(1):7?28.

[17]Kuhstoss S,Richardson MA,Rao RN.Plasmid cloning vectors that integrate site-specifically inStreptomycesspp..Gene,1991,97(1):143?146.

[18]Schweizer HP.Applications of theSaccharomyces cerevisiaeFlp-FRT system in bacterial genetics.J Mol Microbiol Biotechnol,2003,5(2):67?77.

[19]Slauch JM,Camilli A.IVET and RIVET:use of gene fusions to identify bacterial virulence factors specifically induced in hosttissues.Methods Enzymol,2000,326:73?96.

[20]SuzukiN,Nonaka H,Tsuge Y,etal.New multiple-deletion method for theCorynebacterium glutamicumgenome,using a mutant lox sequence.Appl Environ Microbiol,2005,71(12):8472?8480.

[21]Sternberg N,Hamilton D.Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between LoxP sites.J Mol Biol,1981,150(4):467?468.

[22]Volkert FC, Wilson DW, Broach JR.Deoxyribonucleic acid plasmids in yeasts.Microbiol Rev,1989,53(3):299?317.

[23]Sauer B,McDermott J.DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res, 2004, 32(20):6086?6095.

[24]Raynal A,Karray F,Tuphile K,et al.Excisable cassettes:new tools for functional analysis ofStreptomycesgenomes.Appl Environ Microbiol,2006,72(7):4839?4844.

[25]Khodakaramian G,Lissenden S,Gust B,et al.Expression of Cre recombinase during transient phage infection permits efficient marker removal inStreptomyces.Nucleic Acids Res,2006,34(3):e20.

[26]Fedoryshyn M,Welle E,Bechthold A,et al.Functional expression of the Cre recombinase in actinomycetes.Appl Microbiol Biotechnol,2008,78(6):1065?1070.

[27]Komatsu M,Uchiyama T,Omura S,etal.Genome-minimizedStreptomyceshostfor the heterologous expression of secondary metabolism.Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(6):2646?2651.

[28]Herrmann S,SieglT,Luzhetska M,etal.Site-Specific recombination strategies for engineering actinomycete genomes.Appl Environ Microbiol,2012,78(6):1804?1812.

[29]Leibig M,Krismer B,Kolb M,et al.Marker removal inStaphylococcivia Cre recombinase and different lox sites.Appl Environ Microbiol,2007,74(5):1316?1323.

[30]Fedoryshyn M,Petzke L,Welle E,et al.Marker removal from actinomycetes genome using Flp recombinase.Gene,2008,419(1/2):43?47.

[31]RouetP,Smih F,Jasin M.Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.Mol Cell Biol,1994,14(12):8096?8106.

[32]Choulika A,Perrin A,Dujon B,et al.Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system ofSaccharomyces cerevisiae.Mol Cell Biol,1995,15(4):1968?1973.

[33]Jasin M.Genetic manipulation of genomes with rarecutting endonucleases.Trends Genet,1996,12(6):224?228.

[34]Chevalier BS, Stoddard BL. Homing endonucleases:structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility.Nucleic Acids Res,2001,29(18):3757?3774.

[35]Monteilhet C, Perrin A,Thierry A, et al.Purification and characterization of thein vitroactivity of I-SceI,a novel and highly specific endonuclease encoded by a group I intron.Nucleic Acids Res,1990,18(6):1407?1413.

[36]Plessis A,Perrin A,Haber JE,et al.Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus.Genetics,1992,130(3):451?460.

[37]SieglT,Petzke L,Welle E,etal.I-SceI endonuclease:a new tool for DNA repair studies and genetic manipulations inStreptomycetes.Appl Microbiol Biotechnol,2010,87(4):1525?1532.

[38]Posfai G,Kolisnychenko V,Bereczki Z,et al.Markerless gene replacement inEscherichia colistimulated by a double-strand break in the chromosome.Nucleic Acids Res,1999,27(22):4409?4415.

[39]Janes BK,Stibitz S.Routine markerless gene replacement inBacillus anthracis.Infect Immun,2006,74(3):1949?1953.

[40]Lopez CM,Rholl DA,Trunck LA,et al.Versatile dual-technology system for markerless allele replacement inBurkholderia pseudomallei.Appl Environ Microbiol,2009,75(20):6496?6503.

[41]Suzuki N,Nonaka H,Tsuqe Y,et al.Multiple large segmentdeletion method forCorynebacteriumglutamicum.ApplMicrobiolBiotechnol,2005,69(2):151?161.

[42]Wong SM,Mekalanos JJ.Genetic footprinting with marinerbased transposition inPseudomonas aeruginosa.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(18):10191?10196.

[43]Lu ZQ,Xie PF,Qin ZJ.Promotion of markerless deletion of the actinorhodin biosynthetic gene cluster inStreptomyces coelicolor.Acta Biochim Biophys Sin,2010,42(10):717?721.

[44]Song CJ,Geng WT,Wang SF,et al.Streptomycessp. NK660 (Streptomycesalbulus) and its fermentation cultivation method of ε-poly-lysine:CN,201110362088.8.2011-10-03(in Chinese).

宋存江,耿偉濤,王淑芳,等.鏈霉菌 sp.NK660(Streptomyces albulus)及其用于ε-聚賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)方法:CN,201110362088.8.2011-10-03.