巫琴，陳磊，王江新，張衛(wèi)文

天津大學(xué)化工學(xué)院 合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

藍(lán)細(xì)菌，又名藍(lán)藻或藍(lán)綠藻，是一類能夠進(jìn)行放氧光合作用的原核生物。它們能夠利用太陽能和CO2作為唯一的能源和碳源進(jìn)行生長，進(jìn)而經(jīng)基因工程修飾后生產(chǎn)各種生物燃料以及精細(xì)化學(xué)品，因而作為“微生物細(xì)胞工廠”而在近年來倍受關(guān)注[1]。作為一個(gè)新興的基因工程宿主菌，藍(lán)細(xì)菌具有以下優(yōu)勢(shì)：1)藍(lán)細(xì)菌擁有復(fù)雜的光合系統(tǒng)，能夠吸收廣泛波長的太陽光并將其能量直接傳遞給其他形式的能量載體[2]。同時(shí)，藍(lán)細(xì)菌光能利用率是陸生植物的數(shù)倍 (藍(lán)細(xì)菌3%～9%，陸生植物≤0.25%～3%)[3-4]。2)藍(lán)細(xì)菌種類多樣、分布廣泛，培養(yǎng)不需要耕地，甚至可以在極端環(huán)境下生長。例如目前實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的極大螺旋藻Spirulina maxima就可以在高鹽(1.2 mol/L碳酸鈉)、堿性 (pH 8.5～11.0)環(huán)境下生長[5]。因此，通過藍(lán)細(xì)菌合成生物產(chǎn)品能夠解決生物質(zhì)開發(fā)中“與糧爭地”的問題。3)藍(lán)細(xì)菌的生長營養(yǎng)需求低，只需空氣 (CO2和N2來源)、水 (電子和還原劑來源)、簡單的無機(jī)鹽和光 (能源)[6]，不需要糧食作物為原料，降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)，利用大氣中的溫室氣體CO2作為碳源，有希望扭轉(zhuǎn)或減緩全球變暖進(jìn)程。4)藍(lán)細(xì)菌生長比植物快，培養(yǎng)周期短，生長密度高。同時(shí)，具有相對(duì)簡單的遺傳背景，便于基因操作[7]。伴隨著對(duì)藍(lán)細(xì)菌代謝途徑理解的深入以及幾十種藍(lán)細(xì)菌基因組測序的完成，使得人工改造藍(lán)細(xì)菌并將之利用于各種工業(yè)產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)成為可能。

合成生物學(xué)旨在以工程學(xué)思想作為指導(dǎo)，從頭設(shè)計(jì)并構(gòu)建新的生物元件、裝置和系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造[8]。在合成生物學(xué)中，宿主細(xì)胞被擴(kuò)展為“底盤”這一全新概念，正如在汽車工業(yè)中，同一底盤能夠用于多種型號(hào)汽車的構(gòu)建。近年來，合成生物學(xué)的研究聚焦于各種模式微生物的底盤，如大腸桿菌和酵母菌等，極大地加深了對(duì)這些微生物內(nèi)分子系統(tǒng)運(yùn)作機(jī)制的理解，也極大地提高了使用這些微生物系統(tǒng)生產(chǎn)可再生能源、合成精細(xì)化學(xué)品、制造新材料、合成藥物、改善環(huán)境等的能力和效率。例如，加州大學(xué)伯克利Jay Keasling研究組于2003年在大腸桿菌中成功構(gòu)建了青蒿素合成途徑，使其生產(chǎn)成本顯著降低，并已投入工業(yè)生產(chǎn)[9]；加州大學(xué)洛杉磯分校James Liao研究組在2009年通過改造酵母細(xì)胞使其氨基酸代謝中的碳源轉(zhuǎn)引而合成一系列丁醇的衍生物，走出了合成生物能源的重要一步[10]。相比之下，雖然有超過70種藍(lán)細(xì)菌完成了基因組測序，合成生物學(xué)在藍(lán)細(xì)菌方面的研究和應(yīng)用仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于大腸桿菌和酵母菌。鑒于前面提及的藍(lán)細(xì)菌作為工程宿主菌的諸多優(yōu)勢(shì)，我們相信應(yīng)用合成生物學(xué)的技術(shù)和研究策略來優(yōu)化藍(lán)細(xì)菌底盤具有顯著的科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

近年來，研究者在利用光合藍(lán)細(xì)菌合成各種生物燃料和精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域做出很多努力，實(shí)現(xiàn)了乙醇[11]、乙烯[12]、正丁醇[13]、異丁醛[14]、丙酮[15]、異戊二烯[16]、游離脂肪酸[17]、脂肪醇[18]、氫氣[19]等在光合藍(lán)細(xì)菌中的生產(chǎn)。例如，Atsumi等在海生細(xì)長聚球藻Synechococcus elongatusPCC 7942中異源表達(dá)了纈氨酸合成酶，最終提高異丁醇的前體——異丁醛的產(chǎn)量至1 100 mg/L[14]。雖然這些初步研究證明藍(lán)細(xì)菌有作為良好工程底盤的潛能，但目前利用藍(lán)細(xì)菌底盤生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量仍遠(yuǎn)低于其他工業(yè)微生物底盤，例如酵母菌利用葡萄糖糖漿合成乙醇的最大產(chǎn)量已達(dá)到20%(V/V)[20]，而在藍(lán)細(xì)菌系統(tǒng)中的乙醇產(chǎn)量仍處于毫克水平，說明對(duì)藍(lán)細(xì)菌自身的光合效率以及抵抗外界環(huán)境能力的提高將會(huì)是進(jìn)一步提高其合成能力的關(guān)鍵。更值得注意的是，很多工業(yè)產(chǎn)物對(duì)藍(lán)細(xì)菌具有毒害性，藍(lán)細(xì)菌底盤的低耐受性成為提高產(chǎn)量的一大限制因素。如前所述，Atsumi等對(duì)細(xì)長聚球藻S.elongatusPCC 7942培養(yǎng)6 d獲得1 100 mg/L的異丁醛，同時(shí)他們也對(duì)產(chǎn)物毒性進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)不影響該菌株生長的最大異丁醛濃度為750 mg/L[14]。目前，我們對(duì)藍(lán)細(xì)菌作為“自養(yǎng)型人工細(xì)胞工廠”如何忍耐和適應(yīng)各種生物產(chǎn)品的分子機(jī)制所知甚少，為了進(jìn)一步開發(fā)藍(lán)細(xì)菌底盤的工業(yè)應(yīng)用潛力，有必要對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌底盤進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。以下我們針對(duì)底盤優(yōu)化的方式、藍(lán)細(xì)菌光合效率的優(yōu)化、耐受性藍(lán)細(xì)菌底盤的優(yōu)化、藍(lán)細(xì)菌合成產(chǎn)物的外排等方面進(jìn)行系統(tǒng)地綜述。

1 底盤優(yōu)化的方式

優(yōu)質(zhì)底盤應(yīng)具備以下特質(zhì)：生長速度快，能量轉(zhuǎn)化效率高；培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵成本低；遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡單；對(duì)底物、中間代謝物和目標(biāo)產(chǎn)品具有較高的耐受性；良好的環(huán)境適應(yīng)能力[21]。為了改善底盤微生物的細(xì)胞活力，研究者們提出了一系列優(yōu)化策略：

1.1 提高底盤的生長速率以及代謝速率

異源蛋白的表達(dá)會(huì)與宿主競爭細(xì)胞資源，這導(dǎo)致菌株生長速率的降低，而通過動(dòng)態(tài)感應(yīng)回路來調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，能夠改善細(xì)胞代謝平衡和細(xì)胞資源的利用，進(jìn)而提高生長速率。Liao等在大腸桿菌Escherichia coli中設(shè)計(jì)了一個(gè)調(diào)節(jié)回路，通過改造Ntr調(diào)節(jié)子使其能夠根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖水平來控制茄紅素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，提高了茄紅素的產(chǎn)量，同時(shí)改善了生長延滯以及代謝失衡[22]。

1.2 改善底盤對(duì)底物、中間代謝物、目標(biāo)產(chǎn)品的耐受性

策略之一是利用系統(tǒng)生物學(xué)的方法改造全局轉(zhuǎn)錄因子。Alper等利用全局轉(zhuǎn)錄工程 (Global Transcription Machinery Engineering，gTME)方法改造酵母菌Saccharomyces cerevisiae中的轉(zhuǎn)錄因子Spt15p(一種TATA結(jié)合蛋白)和一些其他相關(guān)因子，改善了細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受性并提高了乙醇的產(chǎn)量[23]。另外，空間重排和優(yōu)化途徑酶也可以減少有毒中間代謝物的積累。Dueber等通過在E.coli細(xì)胞中合成支架從而形成分割區(qū)，對(duì)乙酰輔酶A硫解酶 (AtoB)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶 (HMGS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶 (HMGR)進(jìn)行空間重排，優(yōu)化了甲羥戊酸的產(chǎn)量[24]。

1.3 改造外排泵以減少胞內(nèi)的有毒物質(zhì)

將細(xì)胞內(nèi)合成的工業(yè)產(chǎn)品迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外可以降低對(duì)細(xì)胞的毒性。Tsukagoshi等通過異源表達(dá)AcrAB-TolC外排泵，改善了E.coli對(duì)4種烷烴 (己烷、庚烷、辛烷和壬烷)的耐受性[25]。

1.4 提高底盤的環(huán)境適應(yīng)能力

已有多種技術(shù)被應(yīng)用到改善底盤對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中，包括單基因改造、gTME、進(jìn)化工程、基因組重排等，針對(duì)pH、溫度、滲透壓、光照、營養(yǎng)等諸多環(huán)境因素進(jìn)行了改造。例如，Shi等通過基因組重排技術(shù)改造酵母菌S.cerevisiaeSM-3，使其在45℃時(shí)具有最大細(xì)胞活力，大大提高了菌株對(duì)高溫的耐受力[26]。

2 藍(lán)細(xì)菌光合效率的優(yōu)化

光合作用是所有光合微生物生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品的基礎(chǔ)，低效率的光合作用和能量轉(zhuǎn)化會(huì)使得光合微生物缺乏經(jīng)濟(jì)競爭力。盡管藍(lán)細(xì)菌的光合效率是植物的2～3倍，但仍處于一個(gè)較低的水平 (生長期約為5%～7%，生物反應(yīng)器中約為3%)[27]，90%以上的傳遞到光合系統(tǒng)的光子能量以熱量和熒光形式被耗散[28]，這導(dǎo)致基于藍(lán)細(xì)菌來生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品目前在經(jīng)濟(jì)上仍不具備競爭力，因此，提高光合效率對(duì)于進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展“自養(yǎng)型人工細(xì)胞工廠”有著重要的意義。提高藍(lán)細(xì)菌的光合效率可以從光能的捕獲以及光能的轉(zhuǎn)化兩方面入手：

2.1 光能的捕獲

在光合生物的光吸收和初始化學(xué)轉(zhuǎn)化階段，整體光能轉(zhuǎn)化水平僅僅約為50%。提高光能捕獲的可能策略包括：

2.1.1 拓寬吸收光譜

對(duì)于藍(lán)細(xì)菌而言，太陽光譜只有可見光部分(400～700 nm波段)能夠被利用。此外，波長短于葉綠素激發(fā)光 (680～700 nm)的能量在色素間轉(zhuǎn)化的過程中被縮減，而多余的能量作為熱量耗散[29]。同時(shí)，光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ競爭相同波段的太陽光，使得光能轉(zhuǎn)化效率降低了幾乎一半[30]。Blankenship等提出將兩個(gè)光系統(tǒng)之一改造成利用菌綠素吸收太陽光，這種色素主要存在于進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的生物中，擁有最大可達(dá)～1 100 nm的光吸收。改造后兩個(gè)光系統(tǒng)將具有互補(bǔ)的吸收光譜 (400～730 nm以及730～1100 nm)，將光能捕獲效率提高將近一倍[27]。Chen等發(fā)現(xiàn)一種葉綠素f能捕獲不可見光，這也為拓寬光合微生物的吸收光譜提供了一種新的思路[31]。Gressel等報(bào)道了一種在藻類或藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)熒光蛋白的技術(shù)，這種熒光蛋白不僅能夠吸收有害的紫外線，還能夠放射出可被光合系統(tǒng)吸收的光線[32]。

2.1.2 最小化光捕獲天線復(fù)合體

在自然選擇的壓力下，微生物趨向于提高繁殖能力而非獲得最大生物量或者生物產(chǎn)品產(chǎn)量。在同樣的選擇壓力下，藍(lán)細(xì)菌逐漸形成大尺寸的光捕獲天線復(fù)合體 (Light-harvesting antenna complex，LHC)以適應(yīng)低光照的環(huán)境。然而，在高光照的光生物反應(yīng)器中，表層細(xì)胞過多捕獲光子會(huì)阻礙下層細(xì)胞光吸收，同時(shí)大多數(shù)吸收的光能以熱量和熒光形式耗散來保護(hù)細(xì)胞不受光損害，這顯然不利于生物質(zhì)和工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)[33]。近年來，通過最小化光捕獲天線復(fù)合體來解決這一問題的研究多有報(bào)道。一種方式是截短LHC，例如將綠藻模式種株衣藻Chlamydomonas reinhardtii的光捕獲天線復(fù)合體截短后，得到更高的細(xì)胞密度以及氧的釋放量[33-34]。此外，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)LHC的表達(dá)，或者通過異源表達(dá)LHC翻譯抑制劑也能達(dá)到同樣的效果。Mussgnug等通過RNA干擾下調(diào)LHC的表達(dá)獲得的突變株，在強(qiáng)光處理100 min后，顯示出3倍于母株的光合效率[35]。Beckmann等通過異源表達(dá)一種LHC翻譯抑制劑NAB1的活性持久的變體，使得萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的光合效率提高了50%，同時(shí)生長速率也提高了50%[36]。

2.2 光能的轉(zhuǎn)化

藍(lán)細(xì)菌從各種色素和光捕獲天線復(fù)合體吸收來的光能，將通過卡爾文循環(huán)轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，同時(shí)，外界環(huán)境中的碳以CO2的形態(tài)進(jìn)入并以糖的形態(tài)離開卡爾文循環(huán)，這個(gè)過程中能量轉(zhuǎn)化與碳的固定有著緊密聯(lián)系。因此，提高光能的轉(zhuǎn)化效率與提高碳固定效率密不可分。提高光能轉(zhuǎn)化的可能策略包括：

2.2.1 改善碳固定機(jī)制

RuBisCO(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，催化1,5-二磷酸核酮糖與CO2反應(yīng)，同時(shí)也能以O(shè)2作為底物)是卡爾文循環(huán)中的一個(gè)重要的酶[37]。一直以來，人們都在努力提高RuBisCO的催化效率和底物特異性，但研究顯示具有更高RuBisCO催化效率的突變株對(duì)CO2的選擇性則降低[37-38]。到目前為止，在改善RuBisCO功能方面仍沒有突破性的進(jìn)展。羧酶體是存在于一些自養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的多角形或六角形內(nèi)含體，由以蛋白質(zhì)為主的單層膜包圍，內(nèi)含RuBisCO和碳酸酐酶 (CA，催化HCO3?向CO2轉(zhuǎn)化)[39]。在進(jìn)行光合成的過程中，藍(lán)細(xì)菌主動(dòng)將無機(jī)碳以HCO3?的形式泵入細(xì)胞質(zhì)中，而具有半滲透膜的功能羧酶體蛋白外殼允許HCO3?的輸入并阻擋O2的進(jìn)入以及CO2的離開，因而碳酸酐酶催化產(chǎn)生的CO2大量聚集在RuBisCO附近而被固定，進(jìn)而改善由1,5-二磷酸核酮糖與CO2的低反應(yīng)速率以及RuBisCO的低底物選擇性引起的碳固定效率低下問題。在這種機(jī)制的基礎(chǔ)上，研究者們對(duì)藍(lán)細(xì)菌碳固定進(jìn)行了相應(yīng)的研究與改造。Savage等通過對(duì)S.elongatusPCC 7942細(xì)胞骨架進(jìn)行改造從而打亂羧酶體的空間排布，發(fā)現(xiàn)分裂出的細(xì)胞中羧酶體越多則碳固定速率越大[40]。Atsumi等通過將S.elongatusPCC 6301中編碼RuBisCO的rbcLS基因整合入S.elongatusPCC 7942的基因組中，提高了碳固定效率進(jìn)而提高了異丁醛產(chǎn)量[14]。Price等過表達(dá)碳酸氫鹽的運(yùn)載蛋白，同樣達(dá)到了提高光合效率的效果[41]。另外，引入高活性的碳酸酐酶也不失為一種好方法。

2.2.2 優(yōu)化卡爾文循環(huán)

在提高RuBisCO的催化效率和底物選擇性困難的情況下，優(yōu)化卡爾文循環(huán)中的其他酶類或引入其他的固碳方式便成為一個(gè)好的選擇。Zhu等利用“進(jìn)化算法”(Evolutionary algorithm)模擬C3光合作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)碳代謝相關(guān)酶之間的有效分配 (Partitioning)能夠大大提高光合效率[42]。該模型推測有可能存在這種效應(yīng)的關(guān)鍵酶之一是景天庚酮糖二磷酸酶 (SBPase)，這種酶是二磷酸核酮糖 (RuBP)再生過程中的關(guān)鍵酶，一般處于較低的表達(dá)水平。對(duì)SBPase的進(jìn)一步研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SBPase能提高卡爾文循環(huán)中間代謝物濃度，從而增加碳的固定[43-44]。另一方面，不依靠RuBisCO固碳而是引入其他固碳方式的假說也被提出。Bar-Even等利用由現(xiàn)有代謝模塊重組成的計(jì)算機(jī)模型，發(fā)現(xiàn)一些替代碳固定途徑擁有比卡爾文循環(huán)更高的動(dòng)力學(xué)速率[45]。例如，將磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶與天然的C4碳固定循環(huán)核心耦合起來，得到的整體CO2固定速率是卡爾文循環(huán)的2～3倍。

3 耐受性藍(lán)細(xì)菌底盤的優(yōu)化

在化學(xué)品的生產(chǎn)過程中，藍(lán)細(xì)菌會(huì)受到產(chǎn)品以及各種環(huán)境因素的脅迫，進(jìn)而影響其細(xì)胞活力，導(dǎo)致產(chǎn)量下降、發(fā)酵延滯等。為了確保藍(lán)細(xì)菌在工業(yè)生產(chǎn)中的正常進(jìn)行，有必要改善藍(lán)細(xì)菌的耐受性，包括改善對(duì)工業(yè)產(chǎn)品的毒性以及嚴(yán)苛外界環(huán)境 (pH、溫度、滲透壓和光照等等)的耐受性。

3.1 產(chǎn)物耐受性的優(yōu)化

產(chǎn)物毒性是利用微生物生產(chǎn)生物產(chǎn)品中一種常見的問題，特別是對(duì)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量有較高要求的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。多種生物燃料和精細(xì)化學(xué)品對(duì)藍(lán)細(xì)菌都具有毒性，因此，確保藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)菌株和目標(biāo)產(chǎn)品的兼容性十分重要。近年來針對(duì)藍(lán)細(xì)菌對(duì)幾種化學(xué)品的耐受性已取得了一些研究進(jìn)展。

3.1.1 乙醇耐受性

乙醇在目前全球可再生能源的供應(yīng)中占有很高的比例。早在1999年，Deng等就通過在藍(lán)細(xì)菌聚球藻Synechococcussp.PCC 7942中異源表達(dá)單胞菌Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶，獲得了最大230 mg/L的乙醇產(chǎn)量[11]。最近，F(xiàn)u等利用集胞藻Synechocystissp.PCC 6803基因組水平的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，獲得了最大可達(dá)690 mg/L的乙醇產(chǎn)量，同時(shí)該研究組還對(duì)乙醇毒性進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)不影響該菌株生長的最大乙醇濃度為10 g/L[46]。近期，受973項(xiàng)目支持，天津大學(xué)合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在集胞藻對(duì)抗乙醇處理的研究中，利用iTRAQ-LC-MS/MS技術(shù)，共鑒定到24 877個(gè)肽段，對(duì)應(yīng)1 509個(gè)蛋白質(zhì)，覆蓋了集胞藻全基因組預(yù)測蛋白的42%[47]。使用1.5倍變化以及P＜0.05作為閥值，分別鑒定到135個(gè)及293個(gè)蛋白的表達(dá)在24 h及48 h發(fā)生了變化。功能分析表明，光合細(xì)菌采用了一系列反應(yīng)包括膜蛋白的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘導(dǎo)及移動(dòng)相關(guān)的蛋白等來抵御乙醇毒性。此外，細(xì)胞還利用聚羥基脂肪酸積累途徑以及乙二醛酶解毒途徑來對(duì)抗乙醇脅迫。有趣的是，蛋白組分析的結(jié)果還表明，多個(gè)光合作用相關(guān)的蛋白在乙醇處理的樣品中表達(dá)上調(diào)，這與乙醇處理的葉綠素a含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。最后，通過對(duì)菌株進(jìn)行基因敲除，驗(yàn)證了可能的目標(biāo)基因。同時(shí)，研究組采用了新一代的測序技術(shù)，結(jié)合定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)分析，揭示了藍(lán)細(xì)菌的乙醇代謝模型[48]。結(jié)果表明，乙醇暴露導(dǎo)致了應(yīng)激有關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞表質(zhì)的修改，光合作用相關(guān)基因mRNA水平的上調(diào)也進(jìn)一步證實(shí)乙醇耐受在轉(zhuǎn)錄水平層面上的調(diào)控。最后，通過使用基因敲除方法來驗(yàn)證相關(guān)的靶基因在菌株的乙醇耐受性的作用，這一研究給出了一系列改造光合細(xì)胞底盤以提高乙醇抗性的潛在靶點(diǎn)。

3.1.2 丁醇耐受性

丁醇既是重要的大宗化工原料，又是繼乙醇后的一種極具發(fā)展前景的新一代液體燃料。相比于乙醇，丁醇具有更高的能量密度、更低的腐蝕性以及更高的辛烷值。最近，Atsumi等在Synechococcus elongatusPCC 7942中異源表達(dá)了纈氨酸合成酶，這種酶能將丙酮酸核心轉(zhuǎn)化成2-酮異戊酸，最終提高異丁醇的前體異丁醛的產(chǎn)量至1 100 mg/L，獲得450 mg/L的異丁醇，同時(shí)他們也對(duì)丁醇毒性進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)不影響該菌株生長的最大異丁醛濃度為750 mg/L[14]。目前，針對(duì)藍(lán)細(xì)菌丁醇耐受機(jī)制的研究十分有限，因此，天津大學(xué)合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用iTRAQLC-MS/MS技術(shù)探究了集胞藻對(duì)丁醇的響應(yīng)[49]。共鑒定到25 347個(gè)肽段，對(duì)應(yīng)1 452個(gè)蛋白質(zhì)，覆蓋了集胞藻全基因組預(yù)測的蛋白質(zhì)的40%。通過蛋白豐度的相對(duì)定量，鑒定出303個(gè)表達(dá)變化的蛋白。功能分析表明，光合細(xì)菌采用了一系列反應(yīng)包括熱激蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的感應(yīng)、膜蛋白的修飾等來抵御丁醇毒性。圖1描述了丁醇脅迫下的集胞藻細(xì)胞模型，這一模型闡明了推測的對(duì)抗丁醇的分子機(jī)制。

3.1.3 烷烴耐受性

圖1 丁醇脅迫下集胞藻Synechocystis PCC 6803的動(dòng)態(tài)響應(yīng)機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic representation of dynamic responses of Synechocystis PCC 6803 to butanol exposure.

烷烴不僅是燃料的重要來源，而且也是現(xiàn)代化學(xué)工業(yè)的原料。液態(tài)烷烴能被直接應(yīng)用到內(nèi)燃機(jī)中，作為汽油的替代物具有極大潛力。早在60年代后期，包括光合藍(lán)細(xì)菌在內(nèi)多種微生物就被應(yīng)用到烷烴的生物合成中，然而天然菌株的烷烴產(chǎn)量一直處于很低的水平。最近，研究者鑒定出藍(lán)細(xì)菌中兩種與烷烴合成相關(guān)的酶——?；d體蛋白還原酶 (AAR)和乙醛脫羧酶 (AAD)，將這兩種酶在E.coli中異源表達(dá)后細(xì)菌合成并分泌了烷烴，培養(yǎng)40 h后C13-C17烷烴混合物產(chǎn)量達(dá)到～0.3 g/L[50]。然而，藍(lán)細(xì)菌對(duì)烷烴的耐受力很低，并且目前針對(duì)藍(lán)細(xì)菌烷烴耐受機(jī)制的研究十分有限。天津大學(xué)合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用iTRAQ-LC-MS/MS技術(shù)在光合細(xì)胞對(duì)抗己烷處理研究中，共鑒定出1 492個(gè)蛋白質(zhì)，覆蓋了集胞藻全基因組預(yù)測的蛋白質(zhì)的42%[51]。其中，己烷處理的樣品相對(duì)于對(duì)照，分別有164個(gè)和77個(gè)蛋白得到了上調(diào)和下調(diào)。蛋白功能及代謝途徑分析表明，一些常規(guī)的逆境反應(yīng)蛋白的表達(dá)都被上調(diào)；特別是一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜結(jié)合蛋白、抗氧化蛋白及一些硫傳遞系統(tǒng)的蛋白和光合作用相關(guān)的蛋白被誘導(dǎo)，表明這些都是細(xì)胞針對(duì)己烷毒性采用的保護(hù)機(jī)制。

綜合目前的研究進(jìn)展來看，雖然藍(lán)細(xì)菌對(duì)產(chǎn)物毒性的耐受力仍保持在一個(gè)較低的水平，但藍(lán)細(xì)菌對(duì)產(chǎn)物毒性采用的復(fù)雜分子機(jī)制逐漸被揭示，并且報(bào)道中也給出了一系列改造光合細(xì)胞工廠來提高產(chǎn)物抗性和生產(chǎn)能力的潛在靶點(diǎn)。接下來的工作應(yīng)將重點(diǎn)放在如何針對(duì)這些靶點(diǎn)，利用工程策略改造藍(lán)細(xì)菌，例如基因敲除或過量表達(dá)特定基因等。

3.2 環(huán)境耐受性的優(yōu)化

環(huán)境脅迫 (Environmental stress)是指環(huán)境對(duì)生物體所處的生存狀態(tài)產(chǎn)生的壓力。藍(lán)細(xì)菌的生長以及光合作用受到pH、溫度、滲透壓、光照、營養(yǎng)等諸多因素的影響，近年來，藍(lán)細(xì)菌對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制引起了研究者的廣泛光注，原因就在于環(huán)境的改變會(huì)對(duì)菌體的生長和產(chǎn)品的合成造成危害，而具有更高環(huán)境脅迫耐受力的底盤能夠更好地生長并快速積累生物量，進(jìn)而獲得更高的產(chǎn)物量。

3.2.1 鹽脅迫

對(duì)自然環(huán)境中的光合微生物而言，鹽脅迫是最普遍的環(huán)境脅迫因素之一[52]。雖然藍(lán)細(xì)菌在漫長的進(jìn)化過程中適應(yīng)了水生棲息地多變的鹽濃度，但高鹽濃度會(huì)使得水的可用性降低、無機(jī)離子濃度增大，加大對(duì)細(xì)胞的毒性。近來的研究顯示，光合藍(lán)細(xì)菌對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)制主要包括對(duì)有毒無機(jī)離子的主動(dòng)外排以及相容性溶質(zhì)的積累，包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖基甘油、甜菜堿等[52-53]。此外，通過動(dòng)力學(xué)分析，藍(lán)細(xì)菌對(duì)鹽的適應(yīng)過程可以分成了5個(gè)連續(xù)的階段：第一階段細(xì)胞收縮[54]；第二階段細(xì)胞膨脹且外部的鹽 (如Na+和 Cl?)被動(dòng)流入[55-56]；第三階段把有毒的Na+換成K+，同時(shí)激活相容性溶質(zhì)的合成與光合成[55,57]；第四階段在整個(gè)細(xì)胞水平上重組基因的表達(dá)和活動(dòng)模式[56,58-59]；第五階段完全適應(yīng)鹽脅迫[52]。為了系統(tǒng)地理解藍(lán)細(xì)菌對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，近年來已進(jìn)行了大量的基因組水平的研究，包括對(duì)鹽短期響應(yīng)以及長期響應(yīng)的研究。例如，Kanesaki等利用DNA芯片技術(shù)監(jiān)控集胞藻轉(zhuǎn)錄組的響應(yīng)，在用0.5 mol/L的鹽處理30 min后，發(fā)現(xiàn)一些和細(xì)胞核心代謝相關(guān)的基因發(fā)生了變化，包括核糖體基因、與PSⅡ反應(yīng)核心D1蛋白相關(guān)的基因、編碼熱激蛋白和超氧化物歧化酶(SodB)的基因、合成葡萄糖基甘油的基因[60]。Marin等利用DNA芯片對(duì)集胞藻鹽響應(yīng)進(jìn)行了時(shí)間序列分析，在用0.684 mol/L的鹽處理后，發(fā)現(xiàn)整個(gè)鹽響應(yīng)過程可被分為兩個(gè)階段：鹽響應(yīng)初始階段和鹽適應(yīng)長期階段。在鹽響應(yīng)初始階段，大量的基因表達(dá)都會(huì)上調(diào)，然而僅有少數(shù)的基因表現(xiàn)出穩(wěn)定的響應(yīng) (360個(gè)中僅有15個(gè))，能夠在長期響應(yīng)階段得以保持，其中包括編碼葡萄糖基甘油合成酶的基因[59]。Fulda等利用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了適應(yīng)鹽脅迫的集胞藻的細(xì)胞周質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶的表達(dá)有極大的提高[61]。Huang等從純化出的集胞藻質(zhì)膜中鑒定出25種鹽脅迫相關(guān)的蛋白，包括調(diào)節(jié)蛋白GlnB和NrtA、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合蛋白以及一些假設(shè)性蛋白質(zhì)[62]。從以上的研究結(jié)果分析，可以從與有毒無機(jī)離子的主動(dòng)外排以及相容性溶質(zhì)的積累相關(guān)的基因入手，改變相關(guān)的酶活性、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、類囊體膜蛋白，最終改善藍(lán)細(xì)菌的鹽耐受能力。

3.2.2 酸脅迫

藍(lán)細(xì)菌生長的最佳pH為中性偏堿，當(dāng)環(huán)境pH值偏酸時(shí)藍(lán)細(xì)菌的生長會(huì)受到顯著影響。為揭示了藍(lán)細(xì)菌應(yīng)答酸脅迫的代謝機(jī)制，Kurian等利用雙向電泳、MALDI-MS和LC-MS/MS等技術(shù)相結(jié)合的方法分析了集胞藻響應(yīng)酸脅迫的差異表達(dá)蛋白質(zhì)組，鑒定出酸脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白。其中，在pH 7.5、5.5下，對(duì)細(xì)胞質(zhì)成分進(jìn)行分析，鑒定出4種顯著變化的蛋白但不包括一些普遍的應(yīng)激蛋白 (如熱激蛋白和伴侶蛋白)；在pH 9.0、7.5、6.0、5.5下，對(duì)細(xì)胞周質(zhì)成分進(jìn)行分析，不僅鑒定出草酸脫羧酶、碳酸酐酶兩種已知的對(duì)pH平衡起作用的酶，還鑒定出一些顯著變化的未知功能蛋白，包括14種新型蛋白，為改善藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞耐酸性提供了靶點(diǎn)[63]。Uchiyama等利用DNA芯片技術(shù)鑒定了酸脅迫下集胞藻中表達(dá)上調(diào)的基因，發(fā)現(xiàn)其中的一些基因可能是酸脅迫的響應(yīng)調(diào)節(jié)子。通過對(duì)這些基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)一種雙組分系統(tǒng)中的響應(yīng)調(diào)節(jié)子基因slr0081(sphR)的敲除影響酸脅迫下的菌株生長速率，同時(shí)通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)sphR的敲除下調(diào)Slr0967和Sll0939(脅迫相關(guān)蛋白)的表達(dá)，這表明SphR在酸脅迫下6803的生長中具有重要作用[64]。

3.2.3 金屬脅迫

相比于其他非光合微生物，光合藍(lán)細(xì)菌需要更多的金屬元素來輔助光合作用：鐵硫簇、細(xì)胞色素、非血紅素鐵中的鐵元素；水裂解復(fù)合體中的錳元素；質(zhì)體藍(lán)素中的銅元素；葉綠素中的鎂元素。因此，不足或過量的金屬元素會(huì)導(dǎo)致藍(lán)細(xì)菌中的金屬脅迫。針對(duì)這一問題，已經(jīng)進(jìn)行了諸多研究。例如，在鐵缺乏響應(yīng)方面的研究。雖然鐵在自然界中大量存在，但是鐵的低溶解度導(dǎo)致鐵缺乏成為光合自養(yǎng)生長的限制因素。在集胞藻中，鐵缺乏加強(qiáng)了isiA、isiB、idiA基因的表達(dá)，這3個(gè)基因分別編碼PSⅠ的一個(gè)額外天線系統(tǒng)、黃素氧還蛋白、PSⅡ的一個(gè)部分亞基[65-66]。Katoh等鑒定出編碼鐵離子ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的futA1、futA2、futB和futC基因，并發(fā)現(xiàn)鐵缺乏會(huì)誘導(dǎo)fut基因家族的表達(dá)[67]。Sin等利用DNA芯片技術(shù)來鑒定鐵缺乏下轉(zhuǎn)錄水平變化的基因[68]。他們對(duì)3 165個(gè)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平的分析，其中，85個(gè)基因表現(xiàn)出顯著的變化，發(fā)現(xiàn)在低鐵濃度下編碼ATP合成酶和藻膽蛋白的基因下調(diào)，同時(shí)，葉綠素合成、PSⅠ與PSⅡ的組裝、能量代謝相關(guān)的基因也表現(xiàn)出明顯的變化。總的來看，鐵缺乏適應(yīng)機(jī)制主要包括抑制部分光合成基因，調(diào)控大量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將離子和其他代謝物運(yùn)入細(xì)胞并誘導(dǎo)形成一種特殊的代謝狀態(tài)。最近，天津大學(xué)研究組選取4種重要的藍(lán)細(xì)菌在兩種不同金屬脅迫條件，包括鐵缺乏和高濃度銅處理等條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA)方法建立了4種藍(lán)細(xì)菌的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)而通過跨種屬基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較，成功抽提了藍(lán)細(xì)菌對(duì)環(huán)境脅迫的跨種保守性以及物種特異性應(yīng)對(duì)模塊及基因，揭示藍(lán)細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的生存策略[69]。此外，該項(xiàng)研究首次在微生物中引入跨物種的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，所發(fā)現(xiàn)的藍(lán)細(xì)菌環(huán)境響應(yīng)分子機(jī)制是從單一物種的數(shù)據(jù)分析中無法實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于這些新發(fā)現(xiàn)的藍(lán)細(xì)菌抗逆模塊和基因的發(fā)掘與認(rèn)識(shí)，將對(duì)于進(jìn)一步構(gòu)建抗逆境底盤藍(lán)細(xì)菌提供了重要的理論指導(dǎo)。

4 藍(lán)細(xì)菌合成產(chǎn)物的外排

正如前面提到的，改善菌株的產(chǎn)物毒性耐受水平具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)的基因工程策略 (如突變、進(jìn)化工程、基因組重排、基因組文庫構(gòu)建等)一般需要較長的時(shí)間以及人力物力，以提高乙醇耐受力為例，利用進(jìn)化工程獲得乙醇耐受株需要超過6個(gè)月的時(shí)間[70]。不同于傳統(tǒng)的策略，在細(xì)胞上裝備外排泵能夠?qū)⒂卸疚镔|(zhì)驅(qū)逐出細(xì)胞，直接有效地提高底盤的產(chǎn)物耐受性。

外排泵是與有毒物質(zhì)外排有關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要分為兩類：ATP結(jié)合盒 (ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和次級(jí)外排泵。其中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用ATP作為能量來源催化底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，包含兩個(gè)結(jié)合化學(xué)品并提供轉(zhuǎn)運(yùn)通道的跨膜結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)水解ATP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；次級(jí)外排泵利用質(zhì)子或鈉離子梯度作為能量來源，包含3個(gè)亞基：一個(gè)負(fù)責(zé)識(shí)別化學(xué)品和質(zhì)子交換的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白、一個(gè)周質(zhì)連接蛋白、一個(gè)外膜通道[70]。利用外排泵來減弱產(chǎn)物毒性以及提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量吸引了研究者們的廣泛興趣。Dunlop等通過異源表達(dá)來自疏水/兩親外排 (HAE1)家族的外排泵，改善了E.coli對(duì)5種代表性生物燃料 (乙酸香葉酯、香葉醇、α-蒎烯、檸檬烯、己酸合歡酯)的耐受性[71]。同時(shí)，轉(zhuǎn)入了外排泵的檸檬烯生產(chǎn)菌株表現(xiàn)出1.6倍于母株的檸檬烯產(chǎn)量[72]。Teixeira等過表達(dá)了酵母的多抗藥性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr18p(減弱乙醇引起的質(zhì)膜透化并降低胞內(nèi)乙醇濃度)，使得乙醇產(chǎn)量提高了17%[73]。

外排泵在提高藍(lán)細(xì)菌底盤耐受性方面仍少有報(bào)道。針對(duì)光合自養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌缺少輸出親水性初級(jí)代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白這一問題，Niederholtmeyer等對(duì)Synechococcus elongatesPCC 7942進(jìn)行了改造，使其表達(dá)一種蔗糖酶和一種葡萄糖促擴(kuò)散蛋白，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖和果糖的分泌。類似地，他們還表達(dá)了乳酸脫氫酶和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)乳酸在胞外的積累。葡萄糖促擴(kuò)散蛋白和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于MFS(Major Facilitator Super-family)家族，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括促擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和離子耦合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但一般不包括耦合磷酸鍵水解的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些結(jié)果表明相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)親水代謝物的分泌是必要的，證明了能夠通過工程改造藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)和分泌高價(jià)值親水產(chǎn)品[74]。這一策略將來可以應(yīng)用到提高藍(lán)細(xì)菌底盤耐受性方面，通過異源表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將毒性產(chǎn)物輸出到細(xì)胞外，從而提高底盤的耐受性以及產(chǎn)品的產(chǎn)量。

5 展望

光合藍(lán)細(xì)菌作為合成生物學(xué)的底盤具有一系列良好的特質(zhì)，包括利用太陽能、固定CO2、營養(yǎng)需求低、生長迅速、遺傳背景簡單等，作為生產(chǎn)可再生燃料和精細(xì)化學(xué)品的“自養(yǎng)型人工細(xì)胞工廠”已倍受關(guān)注。在大量藍(lán)細(xì)菌基因組測序完成的背景下，近年來，合成生物學(xué)在藍(lán)細(xì)菌底盤優(yōu)化方面已經(jīng)獲得了令人振奮的進(jìn)展，不僅加深了對(duì)藍(lán)細(xì)菌底盤分子機(jī)制的理解，而且為生物燃料和精細(xì)化學(xué)品的規(guī)?；咝a(chǎn)提供必要的技術(shù)支撐。然而，藍(lán)細(xì)菌底盤的優(yōu)化研究仍處于一個(gè)初始階段，在藍(lán)細(xì)菌光合效率的優(yōu)化、耐受性藍(lán)細(xì)菌底盤的優(yōu)化、藍(lán)細(xì)菌合成產(chǎn)物的外排等方面仍需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，功能基因組學(xué)、代謝模型構(gòu)建等系統(tǒng)生物學(xué)手段也有助于藍(lán)細(xì)菌代謝網(wǎng)絡(luò)的改造?？梢灶A(yù)見，隨著合成生物學(xué)的不斷發(fā)展，更高效經(jīng)濟(jì)的光合藍(lán)細(xì)菌底盤將成功構(gòu)建，使得藍(lán)細(xì)菌突破實(shí)驗(yàn)室研究走向大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用成為可能。

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