王維有，曹晨晨，歐 赟，馬秋月，王 宇，周 婕，任迪峰，* ，魯 軍

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100027)

大棗(Fructus jujubae)為鼠李科植物，我國(guó)棗樹(shù)種植面積占世界的98%以上［1］，資源相當(dāng)豐富。環(huán)磷腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一種重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于植物細(xì)胞中［2］，具有重要的生理調(diào)節(jié)作用［3－4］，可用于調(diào)節(jié)免疫［5－6］、抑制哮喘［7］，并能有效治療心肌梗塞、冠心病、牛皮癬等疾病。目前，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)cAMP的應(yīng)用表示出極大興趣，正積極尋找獲取這種天然藥物的手段。針對(duì)棗中cAMP的提取，目前已建立了微波輔助萃取［8］、水提［9］等方法，但這些方法存在能耗大、時(shí)間長(zhǎng)等不足。閃式提取是一種依靠高速機(jī)械剪切力和超動(dòng)力分子滲濾的技術(shù)［10］，其通過(guò)強(qiáng)大的剪切力加速細(xì)胞破碎，以使其中的小分子溶出，因此具有操作簡(jiǎn)單、快速高效的特點(diǎn)。目前，還未有利用閃式提取技術(shù)分離大棗中cAMP的報(bào)道。另外，盡管?chē)?guó)內(nèi)外有不少關(guān)于cAMP的研究，但鮮有關(guān)于其抗過(guò)敏活性的報(bào)道。為了充分開(kāi)發(fā)利用棗中的cAMP，本研究利用閃式提取法，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定大棗cAMP的最優(yōu)提取工藝。在對(duì)提取液粗品進(jìn)行純化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)cAMP抗過(guò)敏活性進(jìn)行初步探討，旨在為大棗cAMP的深入開(kāi)發(fā)和抗過(guò)敏應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大棗 早脆王棗(充分成熟)，采自北京林業(yè)大學(xué)滄州棗園基地;cAMP標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、甲醇(色譜純)、無(wú)水乙醇(分析純)、磷酸二氫鉀(色譜純)北京化學(xué)試劑公司;D101型大孔樹(shù)脂 天津南開(kāi)大學(xué)化工廠;透明質(zhì)酸酶(分析純)、透明質(zhì)酸鉀(分析純)德國(guó)Sigma公司;對(duì)－二甲氨基苯甲醛、鹽酸、硼酸、乙酰丙酮、碳酸鈉等 均為分析純，北京化工廠。

島津LC－10A高效液相色譜儀 含LC－10ATvp泵，SPD－10A紫外檢測(cè)器，C－R8A色譜數(shù)據(jù)處理儀，日本島津;Venusil MP C18色譜柱 天津博納艾杰爾科技有限公司;冷凍離心機(jī) Sigma公司;KQ－500E型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE－5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－88A往復(fù)式水浴恒溫震蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SHB－Ⅲ循環(huán)式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;PL403儀器電子天平 梅特勒－托利多;DZF－6050真空干燥機(jī) 深圳市三諾儀表有限公司;FA1604N電子分析天平 上海精密儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 將準(zhǔn)確稱取的標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度分別為 1、3、5、10、15μg/mL 的溶液。分別取上述溶液各15μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜條件:色譜柱采用Venusil MP C18;流動(dòng)相:20mmol/L磷酸二酸鉀－乙醇(80∶20);流速1mL/min;溫度為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)256nm;進(jìn)樣量為15μL。按照色譜峰面積作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 提取大棗cAMP單因素實(shí)驗(yàn) 將早脆王棗清洗，去核，切片后真空干燥(70℃，95kPa)，粉碎過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取早脆王棗粉10.0g，加入適量體積、適當(dāng)濃度的乙醇混勻，按照料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)等條件進(jìn)行閃式提取，提取液以8000r/min離心兩次，合并上清液后過(guò)0.45μm濾膜，采用高效液相色譜法測(cè)定cAMP含量，cAMP提取率計(jì)算公式如下:

cAMP提取率(μg/g)=提取液中cAMP質(zhì)量(μg)/早脆王棗棗粉質(zhì)量(g)式(1)

1.2.2.1 提取溶劑濃度的影響 10.0g棗粉加入150mL乙醇中，設(shè)定料液比1∶15，提取10s，提取2次，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、15%、30%、45%、60%、75%、90%，按照1.2.2的操作方法測(cè)定cAMP含量。

1.2.2.2 料液比的影響 10.0g棗粉分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加入乙醇，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取10s、提取2次，按照1.2.2的操作方法測(cè)定cAMP含量。

1.2.2.3 提取時(shí)間的影響 10.0g棗粉加入150mL乙醇中，設(shè)定料液比1∶15、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取2次，提取時(shí)間分別為20、40、60s，按照1.2.2的操作方法測(cè)定cAMP含量。

1.2.2.4 提取次數(shù)的影響 10.0g棗粉加入150mL乙醇中，設(shè)定料液比1∶15、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取10s，提取次數(shù)分別為 1、2、3、4 次，按照1.2.2 的操作方法測(cè)定cAMP含量。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)做正交實(shí)驗(yàn)(表1)，以cAMP提取率為指標(biāo)，獲得cAMP的最優(yōu)提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Design of the orthogonal experiment

1.2.4 大棗cAMP粗提物的純化 研究表明，D101型大孔樹(shù)脂適合大棗cAMP提取液的純化［11］。取適量D101型大孔吸附樹(shù)脂，用95%乙醇浸泡12h后水洗至中性;繼續(xù)用5%HCl浸泡6h，水洗至中性;再用5%NaOH浸泡6h，水洗至中性;最后用蒸餾水洗至中性。將處理好的樹(shù)脂用乙醇濕法裝柱，隨后，分別對(duì)最大上樣體積、洗脫液濃度、洗脫流速進(jìn)行考察。

首先將 cAMP提取液濃縮至 20μg/mL，以1.5BV/h的流速上樣，每1h收集一管，每管9mL，收集各時(shí)期洗脫液，過(guò)0.45μm微孔濾膜，進(jìn)行cAMP含量測(cè)定并繪制泄露曲線。

再取過(guò)量cAMP提取液，上樣后靜置吸附12h。以10%乙醇洗脫樣品，流速分別采用0.5、1、1.5BV/h，收集各時(shí)期洗脫液，過(guò)0.45μm微孔濾膜，進(jìn)行cAMP含量測(cè)定。

最后，取適量cAMP提取液上樣6h后靜置吸附12h，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%和50%，以1BV/h的流速洗脫樣品，收集各時(shí)期洗脫液，過(guò)0.45μm微孔濾膜，進(jìn)行cAMP含量測(cè)定。

1.2.5 大棗cAMP提取物抗過(guò)敏活性的測(cè)定

1.2.5.1 透明質(zhì)酸酶體外抑制率的測(cè)定 采用透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn)法(E1son－Morgan法)測(cè)定提純后的cAMP提取物的抗過(guò)敏活性。將2.5mmol/L的CaCl20.1mL加入0.5mL透明質(zhì)酸酶(500U/mL)中，37℃保溫20min;加入待測(cè)液0.5mL，37℃保溫20min;加入0.4mg/mL透明質(zhì)酸鈉液0.5mL，37℃保溫40min后常溫放置5min，加入0.4mol/L NaOH溶液0.1mL，水浴10min，加入乙酰丙酮碳酸鈉溶液0.5mL，沸水浴15min，用水冷卻;加入3mL無(wú)水乙醇10mL，再加入埃爾利試劑1.0mL，混勻，常溫放置20min后，于530nm處測(cè)定吸光值。

透明質(zhì)酸酶抑制率計(jì)算公式為:

透明質(zhì)酸酶抑制率(%)=［(a－b)－(c－d)］/(a－b)×100 式(2)

其中，a為透明質(zhì)酸酶+樣品+透明質(zhì)酸酶鉀的吸光度值，b為醋酸緩沖液+樣品+醋酸緩沖液的吸光度值，c為透明質(zhì)酸酶+蒸餾水+透明質(zhì)酸酶鉀的吸光度值，d為醋酸緩沖液+蒸餾水+醋酸緩沖液的吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)三次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。利用 Excel和SPSS 16.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)cAMP提取率的影響如圖1(a)所示。該圖表明，在0～60%范圍內(nèi)，cAMP提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，提取率不但沒(méi)有增加，反而有所下降。王立霞［12］等人也得出類似結(jié)論。這可能是由于在某一特定濃度下，cAMP分子與乙醇分子間相互吸引力最大，排斥力最小;當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，cAMP溶解處于過(guò)飽和狀態(tài)，有少量分子結(jié)晶析出而使溶解度下降。選乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、60%和75%作為正交實(shí)驗(yàn)的一組因素。

料液比對(duì)cAMP提取率的影響如圖1(b)所示。如圖所示，cAMP提取率隨料液比從1∶5到1∶30逐漸增大。料液比在1∶5至1∶20范圍內(nèi)，cAMP提取率增長(zhǎng)明顯;而當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，提取率增長(zhǎng)則十分緩慢。選料液比1∶10、1∶15 和1∶20 作為正交實(shí)驗(yàn)的一組因素。

提取時(shí)間對(duì)cAMP提取率的影響如圖1(c)所示。由該圖可以看出，cAMP提取率在提取時(shí)間0～40s范圍內(nèi)逐漸增大;在40s后，提取率增加趨于平緩。出于節(jié)約能源與提高效率的考慮，40s即可定為最佳提取時(shí)間。選提取時(shí)間20、40、60s作為正交實(shí)驗(yàn)的一組因素。

提取次數(shù)對(duì)cAMP提取率的影響如圖1(d)所示。由該圖可以看出，cAMP提取率隨著提取次數(shù)的增加而逐漸提高，但增加趨勢(shì)不明顯。當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，提取率僅比提取3次時(shí)高1.6μg/g。綜合考慮，選擇提取次數(shù)1，2，3三個(gè)水平作為正交實(shí)驗(yàn)的一組因素。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及最優(yōu)提取工藝

提取大棗中cAMP的正交實(shí)驗(yàn)按L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行，共9組，其結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析可以看出:極差大小依次為RA＞RC＞RB＞RD，四個(gè)因素對(duì)cAMP提取率影響的主次順序是A＞C＞B＞D，大棗cAMP的最佳提取工藝為A2B2C2D3，即60%乙醇、料液比1∶20、提取時(shí)間40s和提取次數(shù)3次。表3方差分析表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對(duì)cAMP提取率的影響極顯著，提取時(shí)間對(duì)cAMP提取率的影響顯著，而提取次數(shù)對(duì)cAMP提取率的影響不顯著。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor experiments

對(duì)優(yōu)化提取工藝條件(60%乙醇、料液比1∶20、提取次數(shù)3次、提取時(shí)間40s)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，此條件下cAMP的提取率為(149.5±3.6)μg/g。

2.3 純化結(jié)果

2.3.1 泄露曲線 圖2為cAMP提取液泄露曲線，從圖中可以看出，當(dāng)收集流份數(shù)大于9時(shí)，cAMP含量明顯升高，故確定其為漏點(diǎn)。因此對(duì)于D101型大孔吸附樹(shù)脂來(lái)說(shuō)，20μg/mL的cAMP提取液最大上樣體積為70mL。

2.3.2 洗脫流速的影響 圖3顯示出洗脫液流速對(duì)cAMP純化結(jié)果的影響。從圖3(a)中可以看到，洗脫流速為0.5BV/h時(shí)洗脫時(shí)間最長(zhǎng)，而與其他兩個(gè)流速相對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間基本相等;從圖3(b)中可以看到，樹(shù)脂中cAMP提取物在洗脫流速為1BV/h洗脫效果最好。綜合考慮，選擇1BV/h作為洗脫流速。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Result of the orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of the orthogonal experiment

圖2 cAMP提取液泄露曲線Fig.2 The leaking curve of cAMP extracts

2.3.3 乙醇濃度的影響 圖4顯示出洗脫液濃度對(duì)cAMP提取物純化結(jié)果的影響。由圖可知，在20%～40%范圍內(nèi)，乙醇濃度越大，洗脫液中cAMP含量越高，分離效果越明顯。而乙醇濃度高于40%時(shí)，洗脫液中cAMP的含量有所下降，洗脫效果變差。這可能是由于乙醇為介于極性和非極性之間的溶劑［13］，當(dāng)乙醇濃度增大到一定程度時(shí)，越來(lái)越多的羥基與H2O形成氫鍵，導(dǎo)致溶液極性增大，不利于cAMP這種弱極性物質(zhì)的洗脫。由此可知，乙醇濃度為40%時(shí)分離純化效果最佳。

圖3 洗脫液流速的影響Fig.3 Effect of the elution rate

圖4 乙醇濃度的影響Fig.4 Effect of the ethanol concentration

2.3.4 純化結(jié)果 依照上述確定的cAMP最優(yōu)純化條件，將20μg/mL的大棗 cAMP提取液70mL，上樣于D101型大孔樹(shù)脂，控制流速1.5BV/h;上樣完畢后，用40%乙醇以1BV/h流速洗脫180min。將洗脫液真空冷凍干燥，最終可獲得純度為68.5% ±3.4%的cAMP提取物樣品。與王荔［14］等人的研究相比，此純化方法可得到純度更高的cAMP提取物，為將來(lái)的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.4 抗過(guò)敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)1.2.4中純化得到的cAMP提取物進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5表明，cAMP提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制隨前者濃度的提高而逐漸增大，最大抑制率達(dá)96.2% ±4.1%。用SPSS Statistic軟件分析數(shù)據(jù)，建立回歸方程:y=－2.156x2+26.667x+19.716，R2=0.9871，回歸方程p＜0.01。此方程可靠性較高，計(jì)算透明質(zhì)酸酶抑制率為50%時(shí)所需的cAMP提取物質(zhì)量濃度IC50=0.91mg/mL。大棗cAMP的抗過(guò)敏活性檢測(cè)結(jié)果與黃皮葉不同溶劑提取物［15］的抗過(guò)敏相比還要高，說(shuō)明cAMP也是一種具有較強(qiáng)抗過(guò)敏活性的天然物質(zhì)，具有很好的應(yīng)用前景。

圖5 cAMP提取物對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用Fig.5 The inhibitory effect of cAMP extracts on the activity of hyaluronidase

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)獲得了應(yīng)用閃提法獲取大棗中cAMP的最優(yōu)工藝:以60%乙醇為溶劑，料液比1∶20，提取3次，每次提取40s，在該工藝條件下 cAMP提取率達(dá)(149.5±3.6)μg/g。利用D101型大孔樹(shù)脂純化cAMP提取物的結(jié)果表明:20μg/mL cAMP提取液以1.5BV/h流速上樣70mL，用40%乙醇以1BV/h流速洗脫，此手段純化cAMP提取物純度可達(dá)68.5%±3.4%。

利用Elson－Morgan法對(duì)純化后的cAMP提取物進(jìn)行抗過(guò)敏性測(cè)定，其透明質(zhì)酸酶抑制率最大可達(dá)96.2% ±4.1%，顯示出良好的抗過(guò)敏活性，說(shuō)明具有潛在的功能應(yīng)用價(jià)值。

［1］高續(xù)春.棗渣中有效成分的提取分離研究［D］.西安:西北大學(xué)，2007.

［2］Nikolaus A.The current status of cyclic AMP in high plants［J］.Annual Review of Plant Physiology，1977，2(8):123－132.

［3］Schwede F，Maronde E，Genieser H，et al.Cyclic nucleotide analogs as biochemical tools and prospective drugs［J］.Pharmacol＆ Therapeutics，2000，87(2－3):199－226.

［4］Marin D，Dunphy G B，Mandato C A.Cyclic AMP affects the haemocyte responses of larval Galleria mellonella to selected antigens［J］.Journal of Insect Pysiology，2005，51(5):575－586.

［5］Yuen L P，Wong A S T，Auersperg N.Gonadotropins Regulate N－cadherin－mediated Human Ovarian Surface Epithelial Cell Survival at Both Post－translational and Transcriptional Levels through a Cyclic AMP/Protein Kinase A Pathway［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280(15):15438－15448.

［6］Fabiana S，Giorgio F，Cecilia F，et al.Bordetella pertussis Inhibition of Interleukin－12(IL－12)p70 in Human Monocyte－Derived Dendritic Cells Blocks IL－12 p35 through Adenylate Cyclase Toxin－ Dependent Cyclic AMP Induction［J］.Infection and Immunity，2006，74(5):2831－2838.

［7］Fedyk E R，Adawi A，Looney R J，et al.Regulation of IgE and Cytokine Production by cAMP:Implication for Extrinsic Asthma［J］.Clinical Immunology and Immunopathology，1996，81(2):101－113.

［8］崔志強(qiáng)，孟憲軍.微波輔助萃取冬棗環(huán)磷酸腺苷工藝研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(4):163－166.

［9］Wang H H，Lin Y L，Liao J F，et al.The anti－amnesic effects of the water extract of Jujubae Fructus［J］.The Chinese Pharmaceutical Journal(Taipei)，2003，55(5):361－369.

［10］林琎，杜磊，羅萬(wàn)春.幾種常用分離提取設(shè)備的分離提取技術(shù)［J］.實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2010，8(3):4－6.

［11］尤妍.哈密大棗環(huán)磷酸腺昔提取純化工藝研究［D］.烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［12］王立霞，陳錦屏，張娜，等.和田玉棗中cAMP提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(10):234－236.

［13］尤逢惠.大棗cAMP的分離純化工藝研究［D］.合肥:合肥工業(yè)大學(xué)，2007.

［14］王荔，亓樹(shù)艷，莫曉燕.大棗環(huán)磷酸腺苷提取純初步研究［J］.食品科技，2012，37(4):191－194.

［15］趙豐麗，李潔榮，健秀.黃皮葉不同溶劑提取物抗過(guò)敏活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(1):110－112，115.