孫國(guó)娟，李善姬，崔泰花，崔承弼，*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生院，吉林132013;3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002)

蕎麥為蓼科蕎麥屬雙子葉禾谷類植物，是一種重要的雜糧作物，我國(guó)廣泛種植的品種主要有甜蕎和苦蕎兩種［1］。近年來(lái)醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等方面的研究不斷表明［2］，蕎麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值位居所有糧食作物之首，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，以及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，素有“五谷之王”的美譽(yù)。同時(shí)蕎麥還含有其他禾谷類糧食作物所沒(méi)有的葉綠素和類黃酮物質(zhì)，特別是蘆丁的含量很高。蘆丁有軟化血管，降低血糖，調(diào)節(jié)血壓，降低血清膽固醇的作用，同時(shí)對(duì)預(yù)防和治療高血壓、心腦血管疾病等均有一定的藥理作用［3］。最近已有研究報(bào)道，蕎麥具有抗突變和抗腫瘤的作用，但對(duì)蕎麥芽的一些保健功能仍需進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)以蕎麥芽為研究對(duì)象，以小鼠骨髓細(xì)胞微核和小鼠S－180移植性腫瘤為觀察指標(biāo)，對(duì)蕎麥芽提取物的抗突變和抑制腫瘤的藥效作用進(jìn)行了研究，為蕎麥資源的深度開(kāi)發(fā)與利用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥 山西省農(nóng)科院小雜糧研究中心提供;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) Balb/c、ICR小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;小鼠S－180肉瘤細(xì)胞株 由中國(guó)藥科大學(xué)抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;Giemsa色素 天津博迪化工有限公司;N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(MNNG) 日本和光純藥有限公司;甲醇、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等 均為分析純。

FW－200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;JA10003N型電子天平 民橋精密科學(xué)儀器有限公司;HH－S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器廠;MCO－5AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;XDS1D型倒置顯微鏡 上海萬(wàn)衡精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕎麥芽提取物的制備 麥芽(長(zhǎng)度12～16cm，下胚軸厚度約1.8～1.9cm)用粉碎機(jī)粉碎成粉末，然后添加樣品重量10倍的70%乙醇浸泡，在80℃的條件下，每浸泡8h提取一次，共提取3次。合并3次提取液，用減壓過(guò)濾裝置進(jìn)行熱態(tài)過(guò)濾后，再減壓濃縮回收乙醇提取物。取部分提取物加適量水溶解后，根據(jù)溶劑不同的極性，依次用2～3倍正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5種溶劑進(jìn)行萃取，收集各萃取液，包括母液共得到6個(gè)不同極性的粗體部位。最后減壓濃縮，進(jìn)行凍結(jié)干燥，保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2d，無(wú)異常后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，選用健康狀況良好體重18～25g的ICR小鼠每組10只，雌雄各半。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置蕎麥芽苗乙醇提取物及各萃取物溶液10、20、40、80mg/kg 4 個(gè)劑量組及陰性對(duì)照組(蒸餾水)和致突變物對(duì)照組(MNNG 150mg/kg)，按0.2mL/25g灌胃給藥，連續(xù)7d，對(duì)照組同時(shí)以蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?最后2d)，給藥組及致突變物對(duì)照組給予致突變物MNNG 2次，給藥時(shí)間間隔24h，最后一次給藥后6h將各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物頸椎脫臼處死，取兩腿股骨，剔除肌肉，用紗布擦除碎肉和血污，剪去股骨兩端的骨骺后，將吸取適量小牛血清帶針頭的2mL注射器插入骨髓腔內(nèi)，使骨髓迅速?zèng)_入到離心管中，然后待骨髓團(tuán)塊與小牛血清混合均勻后，在離心機(jī)內(nèi)離心10min(1000r/min)，棄掉多余的上清液，留下約0.5mL上清液與沉淀物混和均勻后，用滴管吸取適量，滴在清潔的載玻片上進(jìn)行涂片，長(zhǎng)度約為2～3cm，在空氣中晾干。將已干燥的涂片在甲醇中固定15min左右，然后在Giemsa應(yīng)用液中染色15min后立即用pH6.8磷酸緩沖液沖洗，陰涼干燥處保存。在油鏡下選擇細(xì)胞分散好、形態(tài)完整、染色良好的部位，按一定順序進(jìn)行計(jì)數(shù)。油鏡下觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)中微核(MN)出現(xiàn)的千分率［5－7］。

1.2.3 小鼠 S－180肉瘤細(xì)胞株實(shí)驗(yàn) 選擇培養(yǎng)7～10d的生長(zhǎng)良好的瘤株，無(wú)菌取腹腔積液，用0.9%無(wú)菌生理鹽水按1∶3稀釋成瘤細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，用體重18～20g的Balb/c小鼠42只，每只0.2mL接種至小鼠右側(cè)腋窩下。24h后選擇一般狀態(tài)良好的小鼠，稱重后隨機(jī)分為7組:空白對(duì)照組、乙醇提取物組、正己烷提取物組、氯仿提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組及水提取物組。每組6只，各組溶液灌胃給藥，給藥劑量為0.5mg/kg·d，連續(xù)給藥20d，空白對(duì)照組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液，停藥次日處死動(dòng)物。解剖剝離瘤塊，稱瘤重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率［8－10］。

腫瘤抑制率(%)=空白對(duì)照組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/空白對(duì)照組平均瘤重×100

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS10.0中相應(yīng)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥芽提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的抑制作用

蕎麥芽提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的作用結(jié)果如表1所示，陰性對(duì)照組小鼠的骨髓微核率最低，陽(yáng)性對(duì)照組與蕎麥芽提取物4個(gè)劑量組的微核率均顯著高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)。而不同劑量的蕎麥芽各提取物組與陽(yáng)性對(duì)照組相比微核率顯著下降(p＜0.05)。并且各提取物組隨著濃度的增高，微核率逐漸降低，抑制率的效果逐漸增強(qiáng)。其中蕎麥芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg濃度下，對(duì)小鼠骨髓微核的作用效果最好，抑制率達(dá)73.4%、75.8%、74.2%。蕎麥芽提取物對(duì)MNNG誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞微核的發(fā)生有明顯的抑制效果。

表1 蕎麥芽提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的抑制作用Table 1 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on bone marrow cells of mice

2.2 蕎麥芽提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用

蕎麥芽提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)表2。由表2可以看出，各成分處理組小鼠平均瘤重低于對(duì)照組，各活性成分對(duì)肉瘤均有一定的抑制作用。其中，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為39.5%、38.0%，與空白對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.05)。

表2 蕎麥芽提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用Table 2 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on tumor bearing Balb/c mouse

3 討論

3.1 微核與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)中，比主核小，大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，故稱微核［11］。骨髓細(xì)胞微核分析是檢測(cè)化學(xué)品對(duì)嗜多染紅細(xì)胞干細(xì)胞所產(chǎn)生的致染色體畸變作用，因其快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)很快成為廣泛使用的遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法之一。國(guó)際組織也將其規(guī)定為評(píng)價(jià)食品添加劑、農(nóng)藥、新藥等化合物的安全性必做實(shí)驗(yàn)之一［12］。而且，此法節(jié)省了在處理細(xì)胞群中尋找中期相的時(shí)間，同時(shí)也比分析染色體畸變要方便一些。但是該實(shí)驗(yàn)也受到許多因素的影響，例如小鼠品系、劑量、給藥次數(shù)、給藥途徑、取材部位等。因此，骨髓細(xì)胞微核分析方法有待于進(jìn)一步的研究與探討。

3.2 惡性腫瘤是目前危害人們生命和健康的惡性疾病之一，2010年癌癥已經(jīng)超越心、腦血管疾病成為21世紀(jì)人類的第一殺手，同時(shí)也成為全球最大的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，尋找癌癥的預(yù)防與治療方法受到國(guó)際科學(xué)工作者的普遍關(guān)注和高度重視［13］。而化合物合成的抗癌藥對(duì)人體正常細(xì)胞可能產(chǎn)生毒副作用，因此從天然動(dòng)、植物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分仍是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)之一［14］。蕎麥作為藥食兩用植物，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、不飽和脂肪酸，而且含有其它糧食作物所沒(méi)有的黃酮類化合物，而黃酮類化合物在抗腫瘤方面的作用是目前研究的熱點(diǎn)之一，其抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面［15］。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)蕎麥芽提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行研究，結(jié)果蕎麥芽提取物具有一定的抗腫瘤活性，我國(guó)具有豐富的蕎麥資源，蕎麥芽具有抗腫瘤作用的研究成果將有利于促進(jìn)蕎麥資源的深度開(kāi)發(fā)與利用，將為保健食品開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

4.1 在小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)中，蕎麥芽提取物對(duì)誘導(dǎo)物MNNG導(dǎo)致的染色體損傷具有保護(hù)作用，其中蕎麥芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg濃度下，對(duì)小鼠骨髓微核的作用效果較好，抑制率達(dá)73.4%、75.8%、74.2%。

4.2 在腫瘤的抑制實(shí)驗(yàn)中，蕎麥芽提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤細(xì)胞移植性腫瘤均有抑制效果。其中乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠S－180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用最為明顯，抑瘤率分別為39.5%、38.0%。

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